柴胡提取物对PMS肝气郁证模型大鼠额叶5-HT3A/3BR分布与蛋白表达的影响

李　芳，王杰琼，宋春红，魏　盛，张惠云，乔明琦

(1．北京市丰台妇幼保健院药剂科，北京　100069;2．山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室，山东济南　250355)



柴胡提取物对PMS肝气郁证模型大鼠额叶5-HT3A/3BR分布与蛋白表达的影响

李芳1，王杰琼2，宋春红2，魏盛2，张惠云2，乔明琦2

(1．北京市丰台妇幼保健院药剂科，北京100069;2．山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室，山东济南250355)

中国图书分类号: R-332; R284．1; R256．49; R322．81; R363-332; R392．11; R711．51

关键词:柴胡提取物;经前期综合征;肝气郁证;额叶; 5-HT3AR; 5-HT3BR;蛋白表达

乔明琦( 1955－)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:肝藏象生理病理与情志致病机制，通讯作者，E-mail: qmingqi@163．com

Effects of Bupleurum extract on distribution and expression of 5-HT3A/3BR in frontal cortex of premenstrual syndrome model rats with liver-qi depression

LI Fang1，WANG Jie-qiong2，SONG Chun-hong2，WEI Sheng2，ZHANG Hui-yun2，QIAO Ming-qi2
( 1．Pharmacy Dept，Fengtai Maternal＆Children's Health Hospital of Beijing，Beijing100069，China; 2．Key Laboratory for Classical Theory of Traditional Chinese Medicine of Education Ministry，Shangdong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Key words:Bupleurum extracts; premenstrual syndrome; liverqi depression; frontal cortex; 5-HT3AR; 5-HT3BR; protein expression

经前期综合征肝气郁证( premenstrual syndrome，PMS)症状表现类似于现代医学中的抑郁样情绪改变，前期研究证明PMS肝气郁证的发生与脑内5-HT系统及其受体密切相关［1］，柴胡提取物通过不同分子机制干预PMS肝气郁证的抑郁情绪［2－3］。但是柴胡提取物在5-HT3R水平对PMS肝气郁证经前抑郁情绪的干预机制尚未见报道，因此，本实验选取PMS肝气郁证为动物模型初步探讨柴胡提取物调控抑郁情绪的微观作用机制。

1　材料

1．1实验动物Wistar大鼠，体质量( 180～200) g，♀，由山东中医药大学动物中心提供，实验动物许可证号: SCXK(鲁) 2011－0003。

1．2药品与主要试剂柴胡提取物(青岛阳光海川医药科技发展有限公司生产，批号: 20110526) ; Anti-5-HT3Areceptor antibody ( ab51950)，Anti-HTR3B( MFG40388)，5-HT3A二抗( Abcam，ab-16248)，5-HT3B二抗( sc-2020)。

2　方法

2．1PMS肝气郁证大鼠模型制备及取材根据文献方法选取大鼠(随机分为3组，每组12只)并复制PMS肝气郁证模型［3］，连续造模5 d，治疗组大鼠造模同时灌胃柴胡提取物( 0. 32 g·kg－1)，正常对照组和模型组各给予相同体积的生理盐水。将每组6只大鼠用多聚甲醛心脏灌流，取前额叶，石蜡包被，切片，用于免疫荧光实验。每组另外6只大鼠，于冰块上剥离额叶，放于－80℃冰箱，Western blot实验备用。

2．2免疫荧光双标记法检测大鼠额叶5-HT3A/3BR分布石蜡切片常规脱蜡，抗原热修复，封闭，结合一抗( 1∶400)，复温、洗涤，结合二抗( 1∶500)，洗涤，滴加甘油，封片。置激光共聚焦显微镜下观察5-HT3AR、5-HT3BR在额叶的分布及同位点表达情况。

2．3Western blot方法检测大鼠额叶5-HT3A/3BR蛋白表达

以50μg额叶总蛋白每泳道上样，电泳分离，转膜，封闭。与一抗( anti-5-HT3B1∶400，anti-5-HT3A1∶400)和β-actin ( 1∶1 500)抗体孵育，洗涤，结合各自相应二抗( anti-5-HT3A1∶400，anti-5-HT3B1∶400)孵育，洗涤，用ECL化学发光试剂检测杂交信号。

2．4统计学方法实验数据用Graphpad Prism 5．0统计软件进行单因变量多因素方差分析。

3　结果

3．1各组大鼠额叶5-HT3A/3BR的定位分布各组大鼠额叶5-HT3AR和5-HT3BR阳性细胞共表达呈黄色，细胞核为蓝色荧光，额区阳性细胞均有分布，且多分布于细胞膜，细胞形态多为点状或圆状。

3．2各组大鼠额叶5-HT3AR蛋白表达与正常组相比，模型组额叶5-HT3AR蛋白表达明显升高( P＜0. 05) ;与模型组相比，柴胡提取物组5-HT3AR蛋白表达明显降低( P＜0. 05)。

3．3各组大鼠额叶5-HT3BR蛋白表达与正常组相比，模型组额叶5-HT3BR蛋白表达明显升高( P＜0. 05) ;与模型组相比，柴胡提取物组5-HT3BR蛋白表达降低( P＜0. 05)。

4　讨论

文献报道5-HT3AR和5-HT3BR为5-HT3R最主要的两个受体亚型，且5-HT3AR为5-HT3R离子通道的功能性受体［4］，因此，本实验以大鼠额叶5-HT3A和5-HT3BR作为研究对象。结果发现，PMS肝气郁证模型组大鼠额叶5-HT3AR和5-HT3BR蛋白表达均明显升高，柴胡提取物干预后其蛋白表达明显降低，由此推测PMS肝气郁证模型抑郁情绪的发生可能与5-HT3AR和5-HT3BR蛋白上调有关，柴胡提取物通过下调额叶5-HT3AR、5-HT3BR蛋白表达发挥其抗抑郁样情绪的作用。在下一步的工作中需要继续寻找柴胡发挥其抗抑郁样作用与5-HT3R信号转导通道的关系，以期望更进一步探索PMS的发病机制及柴胡提取物干预PMS肝气郁证经前抑郁情绪的药理作用机制。

(致谢:本文实验在山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室完成，在此深表感谢! )

参考文献:

［1］李芳，香秋梅，宋春红，等．经前期综合征相关性5-羟色胺系统的研究进展［J］．医学综述，2014，20( 22) : 4048－50．

［1］Li F，Xiang Q M，Song C H，et al．The study of premenstrual syndromes associated 5-serotonin system［J］．Med Recapitul，2014，20 ( 22) : 4048－50．

［2］宋春红，李芳，郭英慧，等．舒郁胶囊及主要组份对PMS肝气郁证大鼠海马中CACNA1C蛋白表达和功能的影响［J］．中国药理学通报，2014，30( 10) : 1476－7．

［2］Song C H，Li F，Guo Y H，et al．Effects of Shuyu capsule and its main composition on protein expression and function of CACNA1C in hippocampus of rat with PMS liver-qi stagnation［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 10) : 1476－7．

［3］Gao X X，Sun P，Qiao M Q，et al．Shu-Yu capsule，a Traditional Chinese Medicine formulation，attenuates premenstrual syndrome depression induced by chronic stress constraint［J］．Mol Med Rep，2014，10( 6) : 2942－8．

［4］Lummis S C．5-HT3receptors［J］．J Biol Chem，2012，287( 48) : 40239－45．

作者简介:李芳( 1980－)，女，博士，主管中药师，研究方向:中药调肝方药药理学，Tel: 010-83917191，E-mail: lifanghappy163@163．com;

基金项目:国家自然科学基金资助课题( No 81173163，81173151)

收稿日期:2015－09－01，修回日期: 2015－11－12

文献标志码:A

文章编号:1001－1978( 2016) 01－0146－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．031