莪术提取物调控支架后再狭窄血管平滑肌细胞增殖的研究进展

冒慧敏，刘剑刚，赵福海，史大卓，刘秀华

( 1．北京中医药大学研究生院，北京　100029;2．中国中医科学院西苑医院心血管病研究所，北京　100091; 3．中国人民解放军总医院，北京　100853)



莪术提取物调控支架后再狭窄血管平滑肌细胞增殖的研究进展

冒慧敏1，2，刘剑刚2，赵福海2，史大卓2，刘秀华3

( 1．北京中医药大学研究生院，北京100029;2．中国中医科学院西苑医院心血管病研究所，北京100091; 3．中国人民解放军总医院，北京100853)

中国图书分类号: R-05; R284．1; R322．12; R322．74; R329. 24; R543. 302. 2

摘要:血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells，VSMCs)异常增殖是支架后再狭窄( in-stent restenosis，ISR)的主要病理过程。近年来研究表明，莪术提取物具有抑制VSMCs增殖，进而抑制支架后再狭窄的作用，其发挥作用的有效成分主要有姜黄素和β-榄香烯，其可能的机制与抑制血红素氧合酶-1 ( hemeoxygenase-1，HO-1)表达、细胞外信号调节激酶( extracellular signal-regulated kinase，ERK) MAPK、Akt信号通路，阻滞细胞周期进程相关。该文就近年来莪术提取物调控支架后再狭窄VSMCs增殖的研究进展作一综述。

关键词:支架后再狭窄;血管平滑肌细胞;莪术;增殖;分子机制;姜黄素

史大卓( 1960－)，男，博士，研究员，博士生导师，研究方向:中西医结合心血管病，通讯作者，E-mail: shidazhuo@ 126．com;

刘秀华( 1957－)，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向:病理与病理生理学，通讯作者，E-mail: xiuhualiu98@ 163．com

经皮冠状动脉介入术( percutaneous coronary intervention，PCI)作为血运重建的有效方法之一，目前已经成为治疗冠心病的主要手段。然而，目前PCI术后会面临两个临床问题，一是支架内再狭窄( in-stent restenosis，ISR)，二是支架内血栓的形成。药物洗脱支架( drug-eluting stent，DES)的问世被誉为介入心脏病学领域的一个里程碑，可以明显降低ISR发生率［1］。血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖在ISR发生中发挥重要作用。因而，抑制VSMCs增殖成为防治ISR的新靶点。近年来研究表明，莪术提取物具有抑制VSMCs增殖的作用，本文就近年来莪术提取物调控支架后再狭窄VSMCs增殖的研究进展作一综述。

1　血管平滑肌细胞增殖与支架后再狭窄

药物洗脱支架问世之前，ISR发生率约为30%，然而DES应用后，仍存在7%～13%的再狭窄率［1］。如何防止再狭窄的发生，成为血管介入治疗的难题。ISR发生发展的机制主要包括:血小板的聚集、生长因子的释放、炎症细胞浸润、VSMCs增殖和迁移、细胞外基质重塑。其中，VSMCs异常增殖是ISR发生发展的重要环节。VSMCs有收缩型和合成型两种类型。生理状态下，血管中层平滑肌细胞为收缩型，以维持血管壁的张力。血管损伤后，在细胞因子、生长因子的刺激下，VSMCs由收缩型转变为合成型，表现为复制能力增强，造成VSMCs异常增殖、向内膜下迁移等病理改变，最终导致ISR的发生［2］。刺激ISR VSMCs增殖的细胞因子及生长因子主要包括:血小板源性生长因子( platelet-derived growth factor，PDGF)、胰岛素样生长因子( insulin-like growth factor，IGF)、血管紧张素Ⅱ( angiotensinⅡ，AngⅡ)和炎症因子如白细胞介素( interleukin，IL)等［3］。

细胞因子或生长因子刺激VSMCs后，通过一系列信号转导通路，导致VSMCs增殖。参与VSMCs增殖的细胞内信号通路主要有: ( 1)丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信号通路，其下游主要包括细胞外信号调节激酶( extracellular signal-regulated kinase，ERK) -MAPK、p38-MAPK、c-Jun氨基末端激酶( JNK) -MAPK三个途径; ( 2)环磷酸腺苷-蛋白激酶A ( cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA)信号通路; ( 3)蛋白激酶C ( Protein kinase C，PKC)信号通路［4］。

此外，研究表明，多种microRNA ( miRNAs)在VSMCs表达，并参与调控ISR平滑肌细胞增殖，如miRNA-143、miRNA-145［5］、miRNA-1［6］、miRNA-126［7］等。

值得注意的是，VSMCs增殖也是动脉粥样硬化( arteriosclerosis，AS)、高血压等疾病的重要病理改变。与ISR不同的是，AS发生发展过程中，除了内皮细胞损伤后引起的细胞因子(如PDGF、成纤维细胞生长因子、血栓素A2等)释放外，血液中增高的脂质如极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白等经氧化修饰后，亦可使VSMCs增殖。而在高血压发病过程中，肾素-血管紧张素系统( renin-angiotensin system，RAS)发挥重要作用，其中AngⅡ具有血管收缩作用，其促进VSMCs增殖的作用在高血压发病过程中尤为重要。

2　莪术提取物调控支架后再狭窄血管平滑肌细胞增殖的研究进展

2．1莪术主要化学成分及药理作用中药莪术为姜黄科姜黄属多年生草本植物蓬莪术( Curcuma phaeocaulis Val)、广西莪术( C．kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang)、温郁金( Curcuma wenyujing Y．H．Chen et C．Ling)的干燥根茎，性温，味辛、苦，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效，是临床上常用的活血化瘀中药。莪术的主要活性成分为挥发油和姜黄素类( curcuminoid)。目前，已从莪术油中提取出50余种成分，主要为莪术醇( curcumenol)、莪术二酮( curdione)、β-榄香烯(β-elemene)、吉玛酮( germacrone)以及倍半萜类化合物［8］。姜黄素类化学成分主要包括姜黄素( curcumin)、去甲氧基姜黄素( demethoxycurcumin)及双去甲氧基姜黄素( bisdemethoxycurcumin)［9］。

基础研究表明，莪术提取物作用的分子靶点种类繁多，包括转录因子、生长因子及其受体、调控细胞增殖和凋亡的基因、酶类等。现代药理学研究表明，莪术提取物具有多重药理作用，如抗炎、降脂、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖、抗血栓形成、保护血管内皮细胞等［10］。近年来，莪术提取物预防支架后再狭窄的作用得到广泛的关注，其重要的机制是抑制血管平滑肌细胞的增殖［11］。

2．2动物实验

2．2．1莪术油类赵军礼等［12］将裸金属支架、聚甲基丙烯酸丁酯/纳米二氧化硅涂层支架、莪术油涂层洗脱支架随机植入犬冠状动脉回旋支或前降支，术后4周分析支架段血管组织形态学变化。光镜下观察发现，各组支架段血管内膜均有不同程度的增厚，而莪术油组内膜最薄;形态学分析结果显示，术后4周莪术油组平均新生内膜厚度、新生内膜面积、管腔面积狭窄率均明显小于裸金属支架组和单涂层组。新生内膜主要由VSMCs构成，该研究结果提示，莪术油可能通过抑制VSMCs增殖，从而抑制冠状动脉支架后内膜增生。Zhao等［13］以球囊损伤小型猪建立支架后再狭窄模型，随机分为莪术组分涂层支架( ZES)组、雷帕霉素涂层支架( SES)组以及裸金属支架( BMS)组。与BMS组相比，术后30 d及90 d ZES组、SES组平均管腔面积、管腔直径均明显大于BMS组，ZES组与SES组差异无统计学意义，提示ZES具有良好的抑制内膜增生的作用，其效果与SES类似，其机制可能与抑制VSMCs增殖相关。Wu等［14］观察腹腔注射β-榄香烯( 40 mg·kg－1·d－1)对大鼠颈动脉血管球囊损伤后内膜增生的抑制作用，结果发现，处理14 d后，与模型组相比，腹腔注射β-榄香烯组新生内膜面积减小，管腔面积增大，内膜/中膜比值减少，提示β-榄香烯在预防内膜增生和ISR方面具有潜在价值。

2．2．2姜黄素类Jang等［15］观察不同浓度姜黄素( 50 μg，500 μg)涂层支架( curcumin-coated stents，CCS)预防兔髂动脉再狭窄的效果，研究发现低剂量组药物仅持续释放3 d，而高剂量组姜黄素可持续释放达21 d，且CCS以浓度依赖方式抑制兔髂动脉新生内膜形成。4周后取支架处髂动脉进行形态学分析，结果显示，与裸金属支架组相比，CCS组内膜横切面面积、再狭窄率明显降低，管腔面积增大;免疫组化结果显示，与裸金属支架组相比，高剂量CCS组增殖细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen，PCNA)阳性细胞明显减少。PCNA是真核细胞DNA聚合酶δ的推动因子，协调DNA复制过程，是细胞异常增殖的重要标志［16］。该研究结果提示高剂量CCS可抑制血管平滑肌细胞增殖。Yang等［17］建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，并向损伤动脉周围给予含72 μg姜黄素的pluronic gel溶液200 μL，以含二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide，DMSO)的pluronic gel溶液作为溶剂对照。损伤后14 d，取病变处血管用于HE染色及免疫组化分析。结果发现，与溶剂对照组相比，姜黄素组内膜与中膜比值明显下降(约40%)，且PCNA染色阳性细胞数明显减少，提示姜黄素可通过抑制VSMCs增殖，抑制新生内膜形成。

2．3细胞实验

2．3．1莪术油类笔者以［“莪术”or“莪术油”or“莪术二酮”or“莪术醇”or“吉马酮”or“倍半萜”or“β-榄香烯”］AND“血管平滑肌细胞”为检索式，检索CNKI、万方、维普、pubmed等常用电子检索数据库，结果显示，研究莪术油类化合物抑制血管平滑肌细胞增殖的研究仅1篇，选用的药物为β-榄香烯。该研究发现，不同浓度( 5～100 mg· L－1)的β-榄香烯在24～72 h范围内，可剂量依赖性抑制VSMCs增殖，并能诱导其凋亡。40 mg·L－1β-榄香烯作用于VSMCs 48 h，对细胞增殖的抑制率达46. 71%［14］。

2．3．2姜黄素类纵观近年来研究发现，有关姜黄素类化合物抑制VSMCs增殖作用的研究较多。王天红等［18］观察不同浓度姜黄素抑制大鼠VSMCs增殖和诱导细胞周期停滞的作用。四甲基偶氮唑盐( methyl thiazoliltetracolium，MTT)结果显示，不同浓度姜黄素( 7. 5～120 μmol·L－1)在24～72 h范围内，可浓度时间依赖性抑制VSMCs增殖。30 μmol ·L－1以上浓度姜黄素可明显抑制VSMCs周期进程，使S期及G2/M期细胞数减少，G0/G1期增加; 30 μmol·L－1姜黄素处理VSMCs 12 h后，细胞周期蛋白D1( cyclin D1)表达开始下降，且随着作用时间的延长，其表达呈时间依赖性降低，而p21waf1/cip1随作用时间的延长，其表达上调。该研究提示，姜黄素具有明显的抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，使细胞周期停滞于G0/G1期，可上调G1期细胞周期蛋白cyclin D1的蛋白表达，同时下调细胞周期蛋白激酶抑制蛋白p21表达。Hua等［19］比较了姜黄素和双去甲氧基姜黄素抑制VSMCs增殖的效果。用不同浓度的姜黄素和双去甲氧基姜黄素处理经PDGF-BB ( 10 μg·L－1)刺激的大鼠主动脉平滑肌细胞，采用H3-胸腺嘧啶核苷参入法( H3-TdR)检测细胞增殖情况，结果发现，浓度为1、10、25 μmol·L－1时，双去甲氧基姜黄素抑制增殖的作用明显强于姜黄素，且抑制PDGFβ、Akt、ERK磷酸化的作用也优于姜黄素，而两者抑制活性氧( reactive oxygen species，ROS)产生的作用相近。

2．4莪术提取物调控支架后再狭窄VSMCs增殖的机制

Yang等［17］用PDGF-BB诱导大鼠VSMCs增殖，并探讨姜黄素对VSMCs增殖的抑制作用。Western blot结果显示，姜黄素可抑制PDGF-BB引起的ERK1/2、Akt磷酸化，而对PDGF受体的表达无影响;受体结合试验结果表明，姜黄素可抑制PDGF-BB与VSMCs细胞膜表面PDGF受体的结合。该研究结果提示姜黄素可能是通过抑制PDGF-BB与PDGF受体的结合，抑制信号通路下游ERK1/2、Akt磷酸化，从而发挥抑制VSMCs增殖的作用。

钟毅等［20］发现姜黄素可抑制氧化型低密度脂蛋白( oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖，促进血红素氧合酶-1 ( hemeoxygenase-1，HO-1)蛋白表达，并降低PCNA蛋白表达，该作用呈现浓度依赖性。以HO-1抑制剂ZnPPⅣ和姜黄素共同处理ox-LDL诱导增殖的VSMCs，发现ZnPPⅣ可抵消姜黄素抑制VSMCs增殖的作用。HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶，可通过降解血红素产生一氧化碳( carbon monoxide，CO)、胆绿素和铁离子，CO和胆色素可通过调节VSMCs增殖和迁移发挥保护受损血管的作用［21］。该研究结果提示，姜黄素抑制VSMCs增殖的机制可能与上调HO-1的表达，下调PCNA蛋白的表达相关。

近期有研究表明［22］，姜黄素抑制细胞增殖的作用可能与蛋白质羧基化、DNA氧化损伤以及核仁活动(核仁大小及数量、核蛋白水平和定位等)异常相关。姜黄素干预VSMCs后，核仁内活动发生一系列变化:①SIRT7表达下调和核糖体RNA ( rRNA)启动子异常甲基化导致rRNA合成受阻;②核蛋白表达水平及定位受到影响:羧基化蛋白可在核质和胞质中发现，8-羟基鸟腺嘌呤水平升高提示DNA单链断裂，且核蛋白均转位至核质或胞质;③转位的核蛋白抑制MDM2表达，从而导致p53在核内堆积。沉积的p53可促进靶蛋白的表达，如细胞周期抑制因子p21，最终导致细胞周期阻滞，抑制VSMCs增殖。该研究进一步阐明了姜黄素抑制VSMCs增殖的分子机制，为姜黄素在心血管疾病的应用提供了有力的证据。

3　结语

VSMCs 增殖是ISR发生发展的重要环节。因而，抑制VSMCs对防治ISR具有重要意义。研究显示，莪术提取物具有抑制VSMCs增殖的作用。该类研究ISR动物模型以球囊损伤为主，给药途径主要有药物涂层支架缓慢释放及腹腔注射给药，而VSMCs增殖模型以ox-LDL及PDGF-BB为主。莪术提取物调控支架后再狭窄VSMCs增殖的机制可能与抑制HO-1表达、MAPK/ERK、Akt信号通路，阻滞细胞周期进程相关。纵观目前研究来看，仍存在以下几个问题: ( 1)莪术众多提取物中，对姜黄素的研究较多，而其余提取物的抗ISR研究较少，其化学构成和作用机制仍待我们进一步探索; ( 2)动物实验周期仍较短，最长为90 d，因而莪术提取物抗ISR的远期效应仍有待证实; ( 3)莪术提取物作为涂层支架药物使用，其质量的稳定性和安全性方面的研究仍缺乏。

综上所述，莪术提取物在预防和治疗ISR方面，展现出广阔的前景，应进一步完善药物的安全性和有效性研究。在此基础上，可尝试开展临床研究，以明确其作用机制和临床效果，这对研制具有我国自主知识产权的中药涂层支架具有重要意义。

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Research progress on curcuma zedoary extracts inhibiting vascular smooth muscle cell proliferation in pathological process of in-stent restenosis

MAO Hui-min1，2，LIU Jian-gang2，ZHAO Fu-hai2，SHI Da-zhuo2，LIU Xiu-hua3
( 1．Graduate School，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2．Cardivascular Diseases Center，Xiyuan Hospital，China Academy of ChineseMedical Sciences，Beijing 100091，China; 3．Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China)

Abstract:Vascular smooth muscle cells ( VSMCs) proliferation is the critical pathological process of in-stent restenosis ( ISR)．Recent researches indicate that the traditional Chinese medicine curcuma zedoary ( E’zhu) can inhibit VSMCs proliferation，with a potential value in preventing and treating ISR．The major active components of curcuma zedoary are curcuma and β-elemene．The underlying mechanisms involve the inhibition of hemeoxygenase-1 expression，blockade of extracellular signal-regulated kinase–MAPK and Akt pathways，and subsequent cell cycle arrest．This article reviews the recent progress on curcuma zedoary extracts regulating VSMCs proliferation in ISR．

Key words:in-stent restenosis; vascular smooth muscle cell; curcuma zedoary; proliferation; molecular mechanisms; curcumin

作者简介:冒慧敏( 1989－)，女，博士生，研究方向:中西医结合心血管病，E-mail: maomolly@ sina．com;

基金项目:国家自然科学基金项目( No 81473530) ;国家卫生基金课题项目( No CMH200701110) ;中国中医科学院自主课题项目( No ZZ0708106)

收稿日期:2015－10－20，修回日期: 2015－12－05

文献标志码:A

文章编号:1001－1978( 2016) 01－0019－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．005