猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的构建

谭 波　袁 芳

（1.重庆市潼南区龙形镇畜牧兽医站，重庆　402672；2.重庆市潼南区小渡镇畜牧兽医站，重庆　402681）

猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的构建

谭 波1袁 芳2

（1.重庆市潼南区龙形镇畜牧兽医站，重庆402672；2.重庆市潼南区小渡镇畜牧兽医站，重庆402681）

猪繁殖与呼吸综合征俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种接触性的传染病，主要引起母猪流产及仔猪呼吸系统障碍，对养猪业造成了巨大的经济损失。目前，该病尚无特效药治疗，临床上主要采用弱毒疫苗和灭活疫苗预防免疫，但其存在免疫效果差和返毒等缺陷，使得人们不得不转向其他新型疫苗的研制以控制PRRSV的发生和流行。

病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是利用基因工程重组技术，将病毒产生免疫效应的主要结构蛋白基因重组在表达载体中，在原核或真核细胞中进行表达，使其自动装配成空心颗粒，大小介于 15～400nm之间，形态上与真正的病毒粒子相似，能 激 发 机 体 有 效 的 免 疫 应 答。近 几 年，PRRS 病毒样颗粒疫苗的研究也成为了热点，并取得了一定的成果。本试验采用杆状病毒 - 昆虫表达系统共表达 PRRSV 的 GP5 蛋白和 M 蛋白，包装PRRSV 病毒样颗粒。PRRSV 的 GP5 蛋白及 M 蛋白在病毒的增殖与诱导免疫应答过程中起关键作用。因 此，本 研 究 选择 GP5 蛋 白 和 M 蛋 白 对PRRSV VLPs的形成进行探索，旨在为研制新型的PRRS疫苗奠定基础。

1　实验材料

菌株和质粒HP - PRRSV CQ 毒株由重庆理工大学药学与生物工程学院生物制药实验室分离鉴定保存。杆状病毒转移载体pFastBacl 、 Sf9昆虫细胞、大肠杆菌 DH5α 感受态细胞均由重庆理工大学药学与生物工 程 学 院 生 物 制 药 实 验 室 保 存。大 肠杆 菌DH10Bac购自北京天恩泽科技有限公司。pUC57-GP5 - M 质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

2　基因与引物的设计合成

选取 HP - PRRSV CQ 毒株的 GP5 和 M 蛋白的全部编码基因序列，使用 Vector NTI 软件进行密码子的优化，提高密码子的适应指数；并在2 个基因之间加入终止子和启动子基因，使得两种蛋白能够连续表达；优化后的序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，克隆于 pUC57质粒中。

我国市场中 PRRS 灭活疫 苗主 要 有针 对高致 病 性 毒 株 的NVDC - JXA1及针对经典毒株的 CH-1a和 SD1疫苗，但在使用过程中存在免疫效果差，甚至不能抵抗同源毒株感染的问题；用JXA1株、HUN4- F112株等制成的弱毒疫苗在国内均受到许可，其免疫效果和免疫期均强于灭活疫苗，但鉴于其存在返毒的危险，在使用该疫苗时需特别慎重。某些欧洲国家（如德国）禁止用弱毒疫苗来预防 PRRS，主要采取扑杀的方法净化猪群；美洲和亚洲国家提倡在未发生PRRS 的猪场中避免使用弱毒疫苗，弱毒疫苗只可用在存在 PRRS 的猪群。因此，开发安全有效的新型疫苗势在必行。

病毒样颗粒疫苗作为一种新型的亚单位疫苗，具有免疫原性好、安全性高、易于大规模生产等特点。鉴于 VLPs 疫苗具有无可比拟的优势，它已经被成功地应用于轮状病毒、人乳头瘤病毒、丙肝病毒等疫苗的研发。目前，几种流感病毒的VLPs疫苗也得到了很好的发展，并成功地在猪、犬、鸭、鸡体内进行了免疫效果的评估，都取得了很好的效果。如吕凤林等将编码PRRSV 的 M蛋白、N 蛋白和 GP5 蛋白的基因分别克隆到真核表达载体（PHWD2000、Popi3CAT、pCAGGS、pcD-NA6/TR、pCMV -HA）中同时转染同一细胞系表达3 种蛋白能形成病毒样颗粒，并能产生良好的细胞免疫和体液免疫。杨雷等针对PRRSV 广西株，利用杆状病毒 - 昆虫细胞表达系统，表达 PRRSV 的GP5蛋白和N 蛋白，成功组装成病毒样颗粒，且该病毒样颗粒具有很好的免疫效果。

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有以下优势：杆状病毒宿主界限高，通常只感染节肢动物，在人体细胞中不能复制，不存在潜在的威胁；杆状病毒基因组容量大，可插入多个外源基因，同时可高效表达外源基因；昆虫细胞作为真核表达系统能够对外源蛋白进行糖基化、磷酸化和酰胺化等修饰。

因此，该系统在构建病毒样颗粒疫苗方面具有广阔的应用前景。PRRSV的 GP5蛋白具有很强的抗原表位，可刺激机体产生保护性免疫应答；M蛋白是 PRRSV中最具保守性的非糖基化囊膜蛋白，在细胞免疫中扮演着很好的角色。同时有研究结果表明，这两种蛋白质通过二硫键形成二聚体，该二聚体在病毒出芽时，能使病毒囊膜弯曲，从而使病毒从宿主中放出来，这在病毒增殖的过程中起到了十分重要的作用。不同于以上研究，本研究针对PRRSV 重庆株，利用杆状病毒 - 昆虫细胞表达系统，选用体外表达的PRRSV GP5蛋白、 M 蛋白，并在基因设计阶段进行了密码子的优化，提高蛋白质的表达量，结果显示，共表达的 GP5、M 蛋白具有天然蛋白的活性，并可以自我组装成 VLPs，为 PRRS VLPs疫苗的研究奠定了基础。本试验制备的病毒样颗粒作为疫苗的效果和前景，还需进行相关的动物试验。