microRNA-Let-7a在肺癌患者中的表达及其抑癌机制的探讨①

许文景　黄冬云　陈　平　徐兴祥

(中南大学湘雅二医院呼吸内科，长沙410011)

microRNA-Let-7a在肺癌患者中的表达及其抑癌机制的探讨①

许文景黄冬云陈平徐兴祥①

(中南大学湘雅二医院呼吸内科，长沙410011)

[摘要]目的：探讨非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血清和肺癌组织中microRNA-Let-7a表达水平以及对肺癌细胞侵袭和增殖影响。 方法：选取我院50例NSCLC患者为研究组，50例同期体检健康者为对照组，采用Real-time RCR检测肺癌患者肿瘤组织和血清中microRNA-Let-7a表达水平；对肺癌细胞株A549转染microRNA let-7a mimics后，transwell法观察microRNA-Let-7a对肺癌细胞侵袭的影响，CCK-8法检测肺癌细胞增殖的变化； Real-time RCR及Western blot检测了A549中k-Ras mRNA及蛋白水平。 结果：microRNA-Let-7a在肺癌患者血清中的表达水平显著低于正常健康人群，差异具有统计学意义(P<0.05)，在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)；转染microRNA let-7a mimics后，A549的侵袭和增殖能力显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，A549中k-Ras mRNA及蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)； 结论：microRNA let-7a在肺癌患者肿瘤组织和血清中低表达，并可减弱肺癌细胞的侵袭和增殖能力，且可能通过Ras信号途径发挥作用。

[关键词]microRNA-Let-7a；NSCLC；增殖；侵袭；k-Ras

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是目前世界范围内致死率最高的肿瘤，预后较差[1]。其中80%是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究发现，NSCLC患者的5年生存率仅为15%，并且复发率很高[3]。目前肺癌的治疗仍以手术切除为主，辅以放疗和化疗。肺癌的发生发展及转归是个极其复杂、多基因参与的过程，但发病机制尚未完全明确，越来越多的学者关注肺癌细胞内基因表达对肺癌的影响。microRNA是真核生物中小分子非编码单链RNA，长约22~24个核苷酸，通过和miRNA3′-UTR 非翻译区的碱基配对来调控mRNA的翻译与降解[4,5]。研究发现多种microRNA在肿瘤的发病机制中表现为促癌或者抑癌作用。microRNA-Let-7a是最早发现的microRNA之一，已证实microRNA-Let-7a参与细胞分化、增殖和凋亡、个体发育、机体代谢以及病毒感染等过程[6]，并且在卵巢癌[7]、乳腺癌[8]等多种肿瘤细胞中表达显著下调。microRNA-Let-7a对肺癌细胞影响的报道尚少，本文旨在研究microRNA-Let-7a在肺癌患者组织和血清中的表达，对肺癌细胞侵袭及增殖能力的影响，从而对于肺癌的防治提供一定的理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料研究组： 选取2013年9月~2015年6月期间，本科室肺癌手术患者50例为研究组，男38例，女12例，年龄29～75岁，平均年龄(46.7±8.7)岁。所有患者术前均未经介入或放化疗等治疗，均接受了肺癌根治性切除术，所有患者术后病理学证实为非小细胞肺癌，且未发现远处转移，排除合并其他慢性病如高血压、糖尿病或其他肿瘤等的患者。

对照组： 为同期健康体检人群50例，其中男32例，女18例，年龄31～73岁，平均年龄(51.8±6.1)岁。留取肺癌患者和正常健康组外周血2 ml，静置6 h后，离心取上清；于肿瘤组织术中离体30 min内留取肺癌组织及对应癌旁组织，待测。

1.1.2主要试剂肺癌细胞株A549购自ATCC公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；microRNA let-7a mimics、稳定阴性对照let-7a -NC和引物U6、GAPDH、K-ras购自上海吉玛生物技术有限公司；RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司；Real-time PCR试剂盒购自ROCHE公司；抗K-ras抗体购自Abcam公司；抗β-actin抗体购自SantaCruz公司；羊抗兔二抗购自SantaCruz公司；CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养A549细胞在含10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基中培养，至对数生长期，以1×105个细胞/平皿接种于25 ml培养瓶平皿，置于37℃、5%CO2、95%湿度培养箱，孵育细胞。

1.2.2细胞转染采用脂质体2000(美国Invitrogen公司)对人肺癌细胞株A549中microRNA let-7a的转染，并以PBS、let-7a -NC作为对照，于48 h后检测其干扰效率。

1.2.3检测指标

Real-time PCR检测microRNA let-7a表达水平：将留取的肺癌患者及对照血清、肿瘤组织和转染后A549，依照产品说明书，以U6作为内参，Real-time PCR检测microRNA let-7a的表达水平。

Real-time PCR检测转染后A549中k-Ras mRNA表达水平：将培养至对数生长期的肺癌细胞，用Trizol提取各组总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH作为内参，依照产品说明书，测定k-Ras mRNA的变化。k-Ras引物正向：5′-TTGATTTGTCAGCAGGACCA-3′；反向：5′-GAGAGTTTCACAGCATGGACTG-3′。PCR使用ABI公司的7900型号Real-Time PCR仪器，结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

Western blot检测转染后A549中k-Ras蛋白表达水平：转染后肺癌细胞培养至对数生长期，按照蛋白抽提步骤，提取总蛋白；采用BCA法测定总蛋白浓度，经SDS-PAGE 电泳后转移到NC膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST 洗涤后，分别加入1∶1 000抗k-Ras抗体、1∶500抗β-actin抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h ，再用TBST 洗涤，化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以β-actin条带作为内参，k-Ras条带与其比较，观察k-Ras蛋白表达变化。

细胞迁移实验：将处于对数生长期的转染后肺癌细胞，调整细胞密度至4×105个/ml，按0.1 ml/孔加入到24孔板悬挂式transwell(millipore公司)小室的上层，小室下层加入1 ml的含有10%血清的培养液。培养24 h后，对己迁移至小室下层的细胞进行计数(随机选取5个视野)。

细胞增殖实验：将对数生长期的细胞以50%的汇合率接种至96孔板，每组设置3个复孔，同时设置不含细胞的空白培养基作为对照，37℃，5%CO2，95%湿度下培养24 h后，分别在培养孔加入10 μl CCK-8溶液；孵育2 h，美国biotek(Elx800)酶标仪检测450nm的吸光值，每孔实测OD值需减去空白对照OD值，取三复孔平均值，记录OD值。

2结果

2.1肺癌患者血清中microRNA let-7a的表达水平microRNA let-7a在肺癌患者血清中表达显著低于正常健康人群(表1)，具有统计学意义(t=17.678，P<0.001)，提示了肺癌患者血清中microRNA let-7a的低表达水平，可能与肺癌的发病密切相关。

表1肺癌患者血清中microRNA let-7a的表达水平

Tab.1Expression level of let-7a microRNA in serum of patients with lung cancer

Note：Compared with normal group,1)t=17.678，P<0.001

2.2肺癌患者组织中microRNA let-7a的mRNA表达水平microRNA let-7a在肺癌患者肿瘤组织中 表达显著低于对应的癌旁组织(表2)，具有统计学意义(t=22.845，P<0.001)，提示了肺癌患者肿瘤组织中microRNA let-7a的低水平表达，可能与肺癌的发生发展和预后转归密切相关。

表2肺癌患者组织中microRNA let-7a的表达水平

Tab.2Expression level of let-7a microRNA in tissue of patients with lung cancer

Note：Comparison with adjacent tissues,1)t=22.845，P<0.001

2.3肺癌细胞转染后microRNA let-7a mRNA表达水平变化肺癌细胞株A549转染microRNA let-7a mimics后，同对照相比，microRNA let-7a mRNA的表达水平显著升高(图1)，差异均具有统计学意义(P<0.001)，提示高表达microRNA let-7a肺癌细胞构建成功。

2.4肺癌细胞中microRNA let-7a对细胞增殖的影响肺癌细胞A549转染microRNA let-7a mimics后，同对照相比，肺癌细胞增殖显著减少(图2)，差异具有统计学意义(P<0.001)，提示了microRNA let-7a具有增强肺癌细胞增殖的能力。

2.5肺癌细胞中microRNA let-7a对细胞侵袭功能的影响肺癌细胞A549转染microRNA let-7a mimics后，同对照相比，transwell小室下层细胞数量显著减少(图3)，差异具有统计学意义(P<0.001)，提示了microRNA let-7a具有增强肺癌细胞侵袭的能力。

2.6肺癌细胞A549转染microRNA let-7a mimics后k-Ras mRNA和蛋白表达影响为了探讨microRNA let-7a对于肺癌细胞A549侵袭能力的影响机制，我们检测转染microRNA let-7a mimics基因后肺癌细胞的k-Ras mRNA和蛋白表达水平。结果发现，与对照组比较，k-Ras mRNA和蛋白表达水平均显著降低(图4)，提示microRNA let-7a可能是通过促进肺癌细胞k-Ras的表达影响癌细胞的侵袭能力。

3讨论

肺癌是目前为止世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。全世界每年新发肺癌病例数为180多万，占所有恶性肿瘤新发病例的13%，每年肺癌导致的死亡患者约160万，占所有恶性肿瘤死亡人数的19.4%[9]。在我国，肺癌的发病率和死亡率一直居于所有肿瘤的首位，据统计，2010年我国肺癌发病率占所有恶性肿瘤的19.59%，死亡率占所有恶性肿瘤的24.89%[10]，而且多数肺癌患者就诊时已经是晚期。因此，特异性的基因调控靶点对于肺癌的诊断和治疗至关重要。

microRNA作为一种在转录水平调节基因表达的约22~24个核苷酸大小的小分子RNA，广泛的存在于组织、血浆或血清以及其他体液中，且在体内表达比较稳定。microRNA let-7家族是最早发现的microRNA 之一，具有组织特异性、高度保守性和时序性[11]。近年来研究发现，microRNA let-7a的表达与多种肿瘤发生发展有关，在肿瘤中起到“抑癌基因”的作用，可作为肿瘤诊断和判断预后的检测指标[12]。本研究发现肺癌患者血清中microRNA let-7a的表达显著低于同期健康人群；此外，肺癌患者肿瘤组织中的microRNA let-7a的表达显著低于相对应的癌旁组织，结果均提示microRNA let-7a在肺癌患者血清和肿瘤组织中的表达水平的变化可能是调控肺癌细胞中的信号途径，参与肺癌的发生发展和转归。Sakurai等[13]研究发现乳腺癌患者体内microRNA let-7a表达水平下降，且LIN28通过抑制microRNA let-7a的成熟，参与乳腺癌的发病，这些结果从侧面支持了本研究。

肿瘤细胞的侵袭和增殖能力与肿瘤的转移和生长速度密切相关，影响着肿瘤的发展和转归[14,15]。本研究通过细胞转染技术，在A549细胞株内高表达microRNA let-7a，同低表达microRNA let-7a的A549细胞株相比，通过transwell实验发现高表达microRNA let-7a的肺癌细胞的侵袭能力显著弱于低表达microRNA let-7a的肺癌细胞，说明microRNA let-7a表达水平的高低影响着肺癌细胞的侵袭能力。此外，本研究运用CCK-8实验研究肺癌细胞增殖能力，发现高表达microRNA let-7a肺癌细胞的增殖能力显著弱于低表达microRNA let-7a的肺癌细胞，说明microRNA let-7a表达水平越高，肺癌细胞的增殖能力越弱。microRNA let-7a的表达水平影响肺癌细胞的侵袭和增殖能力。这与Wang等[16]在结肠直肠癌中的研究结果是一致的。

Ras癌基因在人类肿瘤中常发生突变激活，尤其是在胰腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤中[17]。在肺癌的Ras基因家族点突变中90%为k-Ras基因突变，约25%的非小细胞肺腺癌中发现k-Ras基因突变。本研究进一步发现，高表达microRNA let-7a的A549中，k-Ras mRNA及蛋白表达水平显著降低，提示microRNA let-7a可能通过影响k-Ras的表达，从而影响肺癌细胞的侵袭和增殖能力。这与Wang等[18]的研究结果是一致的。

综上所述，在肺癌患者血清和肿瘤组织中microRNA let-7a的表达水平显著降低，而且高表达microRNA let-7a可能减弱肺癌细胞的侵袭和增殖能力，从而使肺癌生长速度减慢，侵袭能力下降，这为肺癌诊断和治疗的新靶点提供了理论参考依据。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-17]

(编辑倪鹏)

Expression of microRNA-Let-7a in patients of Non-small cell lung cancer and anti-tumor mechanism

XUWen-Jing，HUANGDong-Yun，CHENPing，XUXing-Xiang.DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyaNo.2HospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of non-small cell lung cancer(NSCLC) patients and the effects of cancer cell migration and proliferation.Methods: 50 cases of NSCLC patients in our hospital as the study group,50 healthy volunteers were used as control group,we used Real-time RCR to detect the expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of NSCLC patients.Using microRNA let-7a mimics transfected into A549,the level of cancer cell migration was observed by transwell,the level of cell proliferation was observed by CCK-8,the level of k-Ras was observed by Real-time RCR and Western blot.Results: The expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of NSCLC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant (P<0.05).After microRNA let-7a transfected into A549,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant(P<0.05),the mRNA and protein levels of k-Ras were reduced inA549 cells,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: The expression of microRNA let-7a is low in the serum and tumor tissue of NSCLC patients,and may weaken the levels of cancer cell migration and proliferation through the Ras signaling pathway.

[Key words]microRNA-Let-7a;NSCLC;Migration;Proliferation;k-Ras

作者简介：许文景(1976年-)，男，硕士，主治医师，主要从事肺癌与恶性胸腔积液方面的研究。

中图分类号R734.2
①苏北人民医院呼吸内科，扬州225001。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0234-05