鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株asd平衡致死系统的构建及特性的研究①

张春杰　陈松彪　程相朝　廖成水　李　静　何　雷　张明亮　郁　川　余祖华　贾艳艳　赵战勤

(河南省动物疫病与公共安全院士工作站/河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，洛阳471003)

鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株asd平衡致死系统的构建及特性的研究①

张春杰陈松彪程相朝廖成水李静何雷张明亮郁川余祖华贾艳艳赵战勤

(河南省动物疫病与公共安全院士工作站/河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，洛阳471003)

[摘要]目的：为研究用于能够稳定携带外源基因的口服活疫苗载体。方法：本研究以减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsipB为研究对象，利用自杀性质粒pREΔasd介导的细菌同源重组技术，构建SL1344ΔsipBΔasd宿主-载体平衡致死系统，并进一步研究其生物学特性。结果：PCR及测序结果表明SL1344ΔsipBΔasd构建成功。生物学特性结果表明SL1344ΔsipBΔasd的血清型与SL1344ΔsipB相同，并能够稳定遗传缺失后的asd基因；其生长速度和生化特性与亲本株SL1344基本相同，并且该缺失株仍然具有运动性的能力，小鼠攻毒试验表明SL1344ΔsipBΔasd电转了携带asd基因的互补质粒pYA3493后，其毒力较亲本菌株SL1344约降低至1.4%。结论：以上结果证明，减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsipBΔasd菌株构建成功，为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

[关键词]自杀性质粒；宿主-载体平衡致死系统；SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493);口服活疫苗载体

沙门菌能够利用Ⅲ型分泌系统(T3SS)运输毒力因子到宿主细胞中，从而侵害宿主细胞，导致人类和哺乳动物的伤寒和胃肠炎，在公共卫生学上具有十分重要的意义[1]。

已有研究表明沙门菌入侵宿主细胞的过程中主要是由一系列的转运蛋白在发挥作用，这些转运蛋白包括:SipB、SipC、 SipD，它们在细菌的一些毒力因子侵入宿主细胞通过细胞膜的过程中会形成一个离子通道[2]。越来越多的证据表明：SipB,毒力岛1介导的一个效应蛋白，通过Capase-1 介导的激活IL-1b 和 IL-18从而促进宿主细胞坏死和凋亡[3,4]。SipB是沙门菌的一种效应蛋白，与介导细菌的侵入有关，该基因的缺失势必会影响细菌对宿主细胞的入侵能力，从而影响细菌对宿主的毒力，而asd基因主要编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶，该酶是二氨基庚二酸(Dia minopimelic acid,DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要成分。asd缺失株在无外源DAP条件下溶菌死亡。因此，利用asd基因互补系统能够与asd缺失株表型互补，使重组菌在无外源DAP的情况下仍能够存活，从而保证减毒沙门菌携带外源抗原能够持续稳定表达[5]。

SL1344ΔsipB是笔者在亲本菌株SL1344的基础上构建的减毒株[6]，其毒力较亲本菌株相比发生了明显的下降，并且还具有较好的免疫原性。本研究旨在SL1344ΔsipB的基础上构建减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsipBΔasd缺失株平衡致死载体系统，进而为研发更加安全有效的鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗以及开发以鼠伤寒沙门菌SL1344为载体的多价疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细菌菌株、质粒和培养条件鼠伤寒沙门菌SL1344强毒株由南京农业大学惠赠；鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB[7]缺失株均由河南科技大学动物与疫病公共卫生实验室构建并保存；鼠伤寒沙门菌在37℃静止或振摇培养；细胞在37℃和5% CO2恒温培养箱中静置培养。

1.1.2引物根据GenBank上已公布的鼠伤寒沙门菌LT2(GenBank No.AE008859)asd基因序列设计引物，根据鼠伤寒沙门菌invA基因序列合成用于沙门菌的扩增鉴定的特异性引物。各引物均由上海生物工程公司合成(表1)。

表1PCR扩增所用的引物序列

Tab.1Primer sequences for PCR amplification

1.2方法

1.2.1鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsipBΔasd缺失株的构建参照HE等[8,9]的方法并加以改进，吸取100 μl供体菌χ7213(pREΔasd)和受体菌SL1344ΔsipB到1 ml含DAP的LB液体培养基试管中混合培养过夜。取100 μl菌液涂布于含Cm的LB固体平板上培养24 h，挑取Cm抗性(Cmr)结合子，用引物pa1/pa2扩增鉴定。将阳性接合子在含DAP和5%蔗糖的无NaCl的LB(NB)液体培养基中培养过夜，选取合适的稀释度涂布于含DAP和蔗糖的NB(无NaCl的LB固体平板上，筛选白色细小菌落。挑取单菌落分别划线于含蔗糖的NB固体平板和含DAP及蔗糖的NB固体平板上，筛选蔗糖抗性(SUCr)及DAP依赖菌落，并用引物pa1/pa2扩增鉴定。

1.2.2缺失株SL1344ΔsipBΔasd的表型鉴定将培养好的细菌SL1344ΔsipBΔasd、SL1344ΔsipB与亲本株SL1344分别转接到含DAP和不含DAP的葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露醇、麦芽糖等生化鉴定管，研究其生化特性。

1.2.3缺失株SL1344ΔsipBΔasd的遗传稳定性将缺失株SL1344ΔsipBΔasd接种于含DAP的LB液体培养基中连续传代培养60代，挑取第10、20、30、40、50、60代单菌落利用引物pa1/pa2研究asd缺失基因在缺失株中的遗传稳定性。

1.2.4缺失株SL1344ΔsipBΔasd的生长特性分别挑取SL1344、SL1344ΔsipB和ΔsipBΔasdSL1344的单菌落，接种于含DAP和普通的LB培养基中培养过夜，将培养好的菌液连续稀释至合适浓度涂板计数，然后调整菌液初始浓度约至1×106CFU/ml，37℃、180 r/min振摇培养。每1 h取一次样，平板计数并绘制生长曲线。

1.2.5缺失株SL1344ΔsipBΔasd的流动性测定将缺失菌株和亲本菌株调整至相同的初始浓度，将两种菌株分别吸取2 μl的菌液滴到含0.3%琼脂的含DAP的LB半固体平板上面，置于细菌恒温培养箱中培养48 h。

1.2.6缺失株SL1344ΔsipBΔasd的回复试验将原核表达质粒pYA3493电转化至缺失株SL1344ΔsipBΔasd中，之后涂布普通的LB固体平板，筛选出重组菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)。

1.2.7重组菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的毒力测定重组菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)与强毒株SL1344分别在LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，5 000 r/min离心10 min收集菌体，并用PBS溶液重悬细菌调整细菌浓度。每个浓度口服感染6只6周龄BALB/c小鼠，每只200 μl，不断观察直至无小鼠死亡，同时设空白对照组。

2结果

2.1缺失株SL1344ΔsipBΔasd的构建及鉴定缺失株SL1344ΔsipB与大肠杆菌χ7213(pREΔasd)在LB液体培养基中混合培养后，自杀性质粒pREΔasd被整合至SL1344ΔsipB染色体上，因而接合子同时具有asd基因的两个拷贝,即缺失型(315 bp)和野生型(1 803 bp),其表型呈氯霉素抗性且对蔗糖敏感。因而用上臂内部引物pa1和下臂内部引物pa2进行扩增，可以同时得到缺失型(315 bp)和野生型(1 803 bp)两个条带。将阳性接合子在含DAP及5%蔗糖且不含NaCl的LB(NB)液体培养基中培养会发生第二次同源重组。重组之后的结果只有两种，恢复为SL1344ΔsipB或突变为SL1344 ΔsipBΔasd。挑取单菌落用引物pa1/pa2进行扩增鉴定，可得到315 bp的缺失型大小和1 803 bp(SL1344ΔsipB)野生型大小两条带。PCR和测序结果表明SL1344ΔsipBΔasd构建成功。

2.2缺失株SL1344ΔsipBΔasd的表型鉴定玻片凝集试验结果显示SL1344ΔsipBΔasd的血清型为1,4,5,12:i:1,2，同亲本株SL1344ΔsipB和强毒株SL1344相同。生化鉴定结果显示，缺失株与强毒株相比没有发生明显的变化。

2.3缺失株SL1344ΔsipBΔasd的稳定遗传性鉴定将SL1344ΔsipBΔasd在含DAP的LB液体培养基中连续培养60代，挑取第10、20、30、40、50、60代单菌落用引物pa1/pa2做PCR扩增鉴定，结果表明缺失株均能稳定遗传缺失的315 bp的asd片段(图2)。

2.4缺失株SL1344ΔsipBΔasd的生长特性的测定SL1344ΔsipBΔasd、SL1344ΔsipB及亲本株SL1344生长特性结果表明缺失株SL1344ΔsipBΔasd、SL1344ΔsipB的生长速度略慢于亲本菌株SL1344的生长特性，而两种缺失株生长速度无明显差异(图3)。

2.5缺失株SL1344ΔsipBΔasd的流动性的测定将两种细菌在0.3%琼脂的半固体平板上培养48 h后观察，亲本菌株SL1344和缺失菌株均能够形成较明显的运动圈(图4)，说明该基因缺失后对细菌的运动性没有明显的影响。

2.6重组菌株SL1344ΔsipBΔasd的基因互补试验将重组菌株在普通的LB固体培养基中能够连续传30代，这表明构建的重组菌株能够稳定存在，并且可以表达asd基因。

2.7重组菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的毒力测定口服感染SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的LD50是1.60×108CFU，SL1344的LD50是2.30×105CFU,说明SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的毒力较亲本株约下降至1.5%。

3讨论

近年来，由于重组DNA技术的发展和应用，给新型疫苗的制备提供了新的方法。其中，以基因工程减毒细菌活疫苗及其作为载体递呈外源抗原被认为是最有发展前景的研究领域之一[9]。通过基因工程减毒的沙门菌，其减毒后具有有限的侵袭潜能，在体内生长缓慢，能够有效的持续刺激机体产生强有力的细胞免疫、体液免疫以及局部黏膜免疫[10]。更重要的是，基因工程减毒沙门菌还以其有效地呈递抗原、发挥免疫佐剂作用以及激发黏膜免疫的优势被广泛应用于DNA疫苗新型细菌载体的研究中。

本研究中使用的自杀性质粒pRE△asd含有正向选择的氯霉素(Cm)抗性基因和反向选择的蔗糖敏感基因(sacB)两种选择标记，选择重组菌就十分方便、快速，并且定位明确，不影响生物体其他遗传性状，能够完全在自然的生物体环境内研究某一基因的功能，最终获得的重组缺失菌不含任何抗生素抗性基因，就十分便于推广应用。在前期研究中我们发现鼠伤寒沙门菌sipB基因缺失后其毒力会发生显著的降低，并且还有较好的免疫原性[6]。因此，本研究以鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB株为研究对象，采用接合转移的方法将含有缺失315 bp的asd基因的重组自杀性质粒导入鼠伤寒沙门菌SL1344△sipB中，通过同源重组、抗性筛选标记和PCR检测技术，最终筛选出不含任何抗性的鼠伤寒

沙门菌SL1344△sipB△asd基因缺失突变株。并对它们的生物学特性进行了比较，缺失菌株和与亲本菌株相比没有发生太明显的变化。生长速度及生化特性与sipB单缺失株基本保持一致，细菌流动性检测结果表明缺失株仍然具有运动性的能力，说明该基因缺失后不会影响细菌鞭毛相关蛋白的表达。经小鼠毒力测试，SL1344△sipB△asd(pYA3493)双缺失株毒力较亲本株SL1344约下降至1.5%，与SL1344△sipB单缺失株毒力相当，说明Δasd作为营养缺陷型基因，由于与含有asd基因的无抗性质粒互补，可能不影响其毒力，因此其作为疫苗载体具有良好的安全性，并且其构成的宿主载体平衡致死系统，可用于外源基因的稳定表达，为将鼠伤寒沙门菌开发为一种安全高效的口服多价疫苗活载体奠定了基础。

参考文献：

[1]Zhou D,Galan J.Salmonella entry into host cells:the work in concert of type III secreted effector proteins[J].Microbes Infect,2001,3(14-15):1293-1298.

[2]Myeni SK,Wang L,Zhou D.SipB-SipC complex is essential for translocon formation[J].PLoS One,2013,8(3):e60499.

[3]Obregon C,Dreher D,Kok M,etal.Human alveolar macrophages infected by virulent bacteria expressing SipB are a major source of active interleukin-18[J].Infect Immun,2003,71(8):4382-4388.

[4]Dreher D,Kok M,Obregon C,etal.Salmonella virulence factor SipB induces activation and release of IL-18 in human dendritic cells[J].J Leukoc Biol,2002,72(4):743-751.

[5]张明亮，张春杰，程相朝，等.猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究[J].中国兽医科学,2012，42(4):373-379.

[6]陈松彪，李静，郁川，等.鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株的构建及生物学特性[J].中国免疫学杂志,2015,34(2):215-220.

[7]Mezal EH,Bae D,Khan AA.Detection and functionality of the CdtB,PltA,and PltB from Salmonella enterica serovar Javiana[J].Pathog Dis,2014,72(2):95-103.

[8]He Y,Xu T,Fossheim LE,etal.FliC,a flagellin protein,is essential for the growth and virulence of fish pathogen Edwardsiella tarda[J].PLoS One,2012,7(9):e45070.

[9]Spreng S,Dietrich G,Weidinger G.Rational design of Salmonella-based vaccination strategies[J].Methods,2006,38(2):133-143.

[10]Roof MB,Kramer TT,Roth JA,etal.Characterization of a Salmonella choleraesuis isolate after repeated neutrophil exposure[J].Am J Vet Res，1992,53(8):1328-1332.

[收稿2015-04-21修回2015-06-01]

(编辑张晓舟)

Construction and characterization of invasion protein B gene deleted mutantasdhost-vector balanced lethal system

ZHANGChun-Jie,CHENSong-Biao,CHENGXiang-Chao,LIAOCheng-Shui,LIJing,HELei,ZHANGMing-Liang,YUChuan,YUZu-Hua,JIAYan-Yan，ZHAOZhan-Qin.AnimalDiseaseandPublicSecurityAcademicianWorkstationofHenanProvince/TheKeyLabofAnimalDiseaseandPublicSecurity,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003，China

[Abstract]Objective:To develop an oral live vaccine vector which stably carries exogenous genes.Methods: SL1344ΔsipBΔasd host-vector balanced lethal system was constructed by the method of recombinant suicide plasmid-mediated allelic exchange on the basis of attenuated Salmonella typhinurium SL1344ΔsipB.Then,the biological characteristics of SL1344ΔsipBΔasd was analyzed.Results: The results showed that the mutant was stabile with the Δasd gene in vitro;the serotype and growth rate of SL1344ΔsipBΔasd strain was almost same as the parent SL1344ΔsipB and SL1344 strain.And the mutant strains remain swim ming zones.Virulence test in mice showed that the virulence of SL1344ΔsipBΔasd which carried complementary plasmid pYA3493 by electrotransformation decreased by 1.4% compared with SL1344.Conclusion: These results showed that the SL1344ΔsipBΔasd mutant was successfully constructed.It is likely that this mutant should be used as a live vector to express foreign genes.

[Key words]Suicide plasmid;Host-vector balanced lethal system;SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493);Oral live vaccine vector

作者简介：张春杰(1964年-)，女，教授，硕士生导师，主要从事动物疫病防控和分子免疫学方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。

中图分类号S852.612
①本文受河南省科技攻关项目(152102110078)资助。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0210-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.014