三叶青黄酮抗肺癌作用研究

钟良瑞，林　霜，魏克民

(1.浙江中医药大学附属省立同德医院，浙江 杭州　310012；2.浙江省中医药研究院，浙江 杭州　310007)



三叶青黄酮抗肺癌作用研究

钟良瑞1，林霜1，魏克民2

(1.浙江中医药大学附属省立同德医院，浙江 杭州310012；2.浙江省中医药研究院，浙江 杭州310007)

摘要：目的研究三叶青黄酮对肺癌A549细胞增殖抑制和侵袭转移作用及其机制。方法采用MTT法检测三叶青黄酮对A549细胞增殖的抑制作用；集落形成试验检测三叶青黄酮对A549细胞抗癌活性的影响；划痕试验检测三叶青黄酮对细胞迁移力的影响；Transwell实验检测三叶青黄酮对A549细胞侵袭力变化；Western blot法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-2等侵袭转移相关蛋白表达水平。结果三叶青黄酮抑制A549细胞增殖程度与用药浓度、时间呈正相关；随着药物浓度的增高，细胞集落形成的数量明显减少,细胞向划痕区的迁移速度不断减慢；穿过Transwell小室的侵袭细胞亦明显减少；MMP-2、MMP-9蛋白表达逐渐降低，TIMP-2蛋白表达升高，呈浓度依赖性。结论三叶青黄酮能够抑制肺癌A549细胞的侵袭转移，可能与降低MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。

关键词：三叶青；抑制；A549细胞；增殖；侵袭转移；MMP

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康。尽管相关临床治疗方面研究取得重大进展，但其预后仍不理想。肿瘤转移是治疗失败的主要原因之一，临床上近一半患者在确诊时已是晚期，并发生远处转移[1]。因此,抑制转移的新药开发具有重要意义。

三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDielset)，又名蛇附子、三叶对、金丝吊葫芦等。块根或全草入药，可清热解毒、祛风化痰、活血止痛，用于高热惊厥、肺炎、哮喘、咽痛、肝炎、风湿等症[2-3]。抗肿瘤方面的作用也越来越受关注。三叶青对肿瘤细胞的凋亡作用有较多前期研究[4-5]，但其对肿瘤侵袭转移方面的研究尚未见报道。本研究探讨三叶青黄酮(radix tetrastigma hemsleyani flavone, RTHF)对肺癌A549细胞侵袭转移的抑制作用，为三叶青进一步开发和临床应用提供依据。

1材料

1.1细胞株A549细胞株由浙江省医学科学院提供，由浙江中医药大学实验室培养传代，实验中所用为生长状况良好的细胞。

1.2药品与试剂三叶青购自浙江省中医药研究院，由浙江省中药新药研发重点实验室提取制备。Hyclone胎牛血清；RPMI 1640培养液：杭州吉诺生物医药技术有限公司。Transwell小室：美国Corning公司；Matrigel胶：美国BD公司。MMP-2、MMP-9、TIMP-2：美国CST公司。

1.3仪器3111型CO2细胞培养箱：美国Thermo公司；3001型酶标仪：美国Thermo公司；蛋白印记检测系统：美国Bio-Rad公司；IX71型倒置显微镜：日本OLYMPUS公司。

2方法

2.1细胞培养培养液均为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，培养条件为37℃、含5% CO2的细胞培养箱内。待细胞长满瓶底后，胰酶消化，分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.2MTT检测抑制率取对数生长期的A549细胞，计数细胞密度为5×107·L-1的细胞悬液，每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板，贴壁后更换培养液并加不同浓度三叶青黄酮(0、0.5、1、5、10 g·L-1)分5组，每组6复孔；分别在24、48、72 h检测，570 nm为检测波长，统计每组各孔吸光度OD值。根据公式：抑制率/%=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%，计算三叶青黄酮对A549细胞的抑制率。

2.3集落形成实验A549细胞以1 000个/孔密度接种于6孔板内，贴壁后加不同浓度三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L-1)，于37℃培养箱内培养10 d。经多聚甲醛固定，结晶紫染色10 min，蒸馏水充分清洗，在显微镜下对含50个细胞以上的克隆进行计数，并用相机对6孔板拍照。

2.4划痕试验检测细胞迁移力将A549细胞接种于6孔板内培养，待细胞基本长满，用200 μL枪头于细胞层中纵向划痕，造成培养细胞缺损区域带，加入不同浓度的三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L-1)继续培养24 h，倒置显微镜下观察划痕处细胞的覆盖情况。

2.5Transwell侵袭实验检测A549细胞的侵袭力将Matrigel胶铺到transwell上室。A549细胞(2×104个细胞/孔)悬浮于含不同浓度三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L-1)的无血清培养基中并接种在上室；下室中加含10%胎牛血清的培养基作为趋化，5% CO2、37℃孵育16 h，培养结束时，用棉签擦去上室上面的非侵袭细胞和Matrigel胶，经多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。显微镜下计数细胞，取均值。

2.6Western blot检测侵袭转移相关蛋白冰上操作，快速刮下细胞，移至1.5 mL离心管。每瓶细胞加250～500 μL RIPA裂解液，1 200 r·min-1离心5 min，收获蛋白，测定蛋白浓度。用SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，一抗室温孵育2～3 h，二抗室温孵育1 h。室温下，ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反应3～5 min，放入蛋白印记检测系统的暗箱内，在暗室中，曝光、显影，以β-actin作为内参进行分析。

3结果

3.1三叶青黄酮对A549细胞增殖的影响不同浓度三叶青黄酮作用不同时间后，A549细胞的增殖抑制率见Tab1，各浓度对A549细胞有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加、时间延长，其抑制作用逐步增强，呈明显的浓度、时间-效应关系。各组间差异有统计学意义(P<0.01)。

3.2三叶青黄酮对A549细胞生长影响与空白对照组比较，随药物浓度增加，细胞集落数量明显减少，与MTT结果相符(Fig 1)。

A:Control group;b:1 g·L-1;c:5 g·L-1;d:10 g·L-1

3.3三叶青黄酮对A549细胞迁移力的影响与对照组比较，24 h时各组划痕区均出现不同程度的变窄；随着药物浓度的增高，A549细胞向划痕区的迁移速度不断减慢，10 g·L-1组细胞划痕区变窄不明显。可见三叶青黄酮抑制A549细胞的迁移存在一定的剂量依赖性(Fig 2)。

3.4三叶青黄酮对A549细胞侵袭力的影响随三叶青黄酮浓度增加，侵袭的细胞明显减少，呈一定浓度依赖性。与对照组比较，三叶青黄酮1 g·L-1时侵袭A549细胞减少到65%，10 g·L-1时细胞减少到39%，差异有显著性(Fig 3)。结果表明，三叶青黄酮可明显抑制A549细胞侵袭转移。

**P<0.01vscontrol goup

A：Control group；B：1 g·L-1；C：5 g·L-1；D：10 g·L-1

3.5三叶青黄酮对A549细胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表达水平的影响不同浓度三叶青黄酮处理A549细胞48 h后，与空白对照组相比，随着药物剂量增加，MMP-2、MMP-9蛋白表达逐渐降低；TIMP-2蛋白逐渐升高，差异明显(Fig 4)。

A：Control group；B：1 g·L-1；C：5 g·L-1；D：10 g·L-1

4讨论

肿瘤治疗失败的主要原因之一是转移，控制转移是决定患者预后的关键因素之一。肿瘤转移的发生包括细胞增殖、黏附、侵袭等方面，机制复杂[6]。目前中药的抗癌机制研究受到关注，在促进凋亡、抑制增殖、侵袭转移等方面已取得突破。三叶青具有清热解毒、祛风化痰、活血化瘀、抗炎镇痛等作用；抗肿瘤方面亦具有良好治疗效果。因此，本实验深入研究三叶青抗肺癌的机制具有重要意义。

本实验通过体外实验MTT证实：三叶青黄酮能抑制人肺癌细胞株A549的增殖，且具有浓度、时间依赖性。药物浓度为10 g·L-1、作用时间72 h时，对细胞的抑制率最高，表明三叶青黄酮能够明显抑制肺癌细胞的增殖。肿瘤转移过程中，肿瘤细胞穿过细胞外基质是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要环节[7]；肿瘤细胞的侵袭有赖于细胞迁移能力的强弱。本研究通过划痕实验，显示三叶青黄酮能够抑制肺癌A549细胞的迁移，且与浓度呈正相关性。在显微镜下观察经结晶紫染色后穿透Transwell小室的A549细胞数量，随着三叶青黄酮浓度增加，细胞数量明显减少，差异有显著性。本研究证实三叶青黄酮可以明显抑制A549细胞的增殖和侵袭转移。

肿瘤细胞中存在多种蛋白水解酶降解细胞外基质(ECM)[8]，金属蛋白酶家族(MMPs)在细胞外基质降解，促进肿瘤细胞迁移和转移等过程中发挥了关键作用[9],其中MMP-2和MMP-9是肿瘤细胞分泌的两个主要的蛋白酶[10]。有研究证实，抑制MMP-2可明显抑制胃癌细胞侵袭和转移[11]。MMP-9可特异性降解细胞外基质中的IV型胶原，在细胞侵袭和迁移中起到重要作用。TIMPs是内源性抑制剂，能阻断MMPs的活性。MMPs和TIMPs之间的平衡决定MMP总体活性。TIMPs的过表达被证实可减少转移，TIMP-1和TIMP-2分别与MMP-9和MMP-2有很高的亲和力[12]。研究发现，TIMP-2的高表达能抑制体内和体外内皮细胞和肿瘤细胞的侵袭[13-14]。本实验通过Western blot检测结果显示，与对照组相比，随三叶青黄酮浓度增加，MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，TIMP-2蛋白表达增加，提示三叶青黄酮通过调节MMPs抑制A549细胞侵袭转移。

综上所述，三叶青黄酮对肺癌A549细胞具有抑制增殖和侵袭转移作用。通过降低MMP-2和MMP-9蛋白，增强TIMP-2蛋白表达可能是其调节机制之一。

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Inhibitory effects of Radix Tetrastigma Hemsleyani Flavone on growth and invasion of lung carcinoma cells

ZHONG Liang-rui1，LIN Shuang1，WEI Ke-min2

(1.TongDeHospitalofZhejiangProvince,AffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310012,China;2.ZhejiangAcademyofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310007,China)

Key words:Radix Tetrastigma Hemsleyani; inhibition; A549 cell; proliferation; metastasis; MMP

Abstract：AimTo study the effect of Radix Tetrastigma Hemsleyani Flavone(RTHF) on the proliferation and invasion in lung carcinoma A549 cells as well as the possible mechanisms underlying these processes.MethodsA549 cells were treated with different concentrations of RTHF for different time. MTT assay and colone formation assay were used to detect the ability of cell proliferation. Wound healing methods and transwell chamber assay were adopted to determine cell migration and invasion. Western blotting assay was used to detect the expression of metastasis-related proteins MMP-2, MMP-9, and TIMP-2.ResultsRTHF obviously suppressed the proliferation of A549 cells in a dose-and time-dependent manner. Microscope found an apparent decrease of cells in the denude zone of cell migration and transwell testing results show that the treatment of invasion was significantly lower than the proportion in the control group(P<0.01). The protein expressions of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated and that of TIMP-2 was up-regulated in a dose-dependent manner.ConclusionRTHF inhibits the growth and invasion of lung carcinoma A549 cells, which might be achieved by down-regulating the expressions of MMP-2 and MMP-9 protein.

收稿日期:2015-12-20,修回日期:2016-02-12

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81541084);浙江省自然科学基金资助项目(No LQ15H290006)

作者简介：钟良瑞(1982-)，男，博士，主治医师，肿瘤学,E-mail: julary@163.com; 魏克民(1938-)，男，研究员，教授，博士生导师，通讯作者，E-mail: wkmcyzy@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.008

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0480-04

中国图书分类号：R284.1；R329.24；R734.202.2；R979.1；R977.6

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.016.html