酒精性肝病动物模型研究进展

周　恒，李　俊，王　华，3

(安徽医科大学 1.药学院、2.第一附属医院肿瘤科、3.肝病研究所，安徽 合肥　230032)



酒精性肝病动物模型研究进展

周恒1,2，李俊1，3，王华1,2，3

(安徽医科大学 1.药学院、2.第一附属医院肿瘤科、3.肝病研究所，安徽 合肥230032)

摘要：长期饮酒是全世界导致慢性肝病的重要原因，可导致肝硬化和肝癌。缺乏能够完全模拟人类酒精性肝病的动物模型限制了酒精性肝病病理机制的研究。因此，建立或者改进酒精性动物模型对于研究酒精性肝病机制，进而提出治疗方案具有重要意义。目前，使用最广泛的酒精性肝损伤模型有急性酒精灌胃模型、Lieber-DeCarli模型、Tsukamoto-French模型和Gao-binge模型等，该文总结并评价了这些酒精性肝病的动物模型，这些动物模型为研究酒精性肝病和开发新的治疗性药物提供了非常有用的研究工具。

关键词:酒精性肝病； 动物模型； 脂肪肝； 肝损伤； 炎症； 纤维化

我国是肝病大国，严重威胁我国人民健康，由于乙肝疫苗的普及、抗肝炎病毒药物的应用和传染病防治方法的有效实施，病毒性肝炎新发病例不断减少[1]；与之相反，随着人民生活水平的提高，酒精滥用引起的酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的发病率迅速增加[1-2]。酒精是全球范围内最频繁饮用并且被广泛认可具有肝脏毒害作用，ALD已经成为世界范围内导致慢性肝病的重要原因。大约90%的重度饮酒者(酒精摄入多于60克/天)呈现脂肪肝，而只有10%～35%的重度饮酒者会发展成酒精性肝炎，5%～15%的重度饮酒者会发展成肝硬化[2]。美国国立卫生院酒精滥用与成瘾研究所(NIAAA/NIH)最新的一份调查报告显示，肝硬化已成为美国导致死亡的第12大原因。2007年共有29 925例病人死于肝硬化，这其中有48%是和酒精相关的。在我国，酒文化源远流长，但其引起的健康问题特别是酒精相关性肝损伤在我国长期没有得到应有的重视，严重威胁我国人民的身体健康[1]。ALD的疾病谱很广，包括从轻微的脂肪变性到脂肪肝、纤维化、肝硬化和肝癌[2]。临床上，ALD的治疗上缺乏有针对性的靶点治疗方法，临床上只能被动的以对症处理为主(用营养支持来防治营养不良和用糖皮质激素来控制炎症)[3]。因此，建立更接近人类ALD的动物模型，利用这些动物模型研究其发生机制，进而发现新的治疗靶点等，均具有非常重要的医学基础理论和临床价值。然而，到目前为止，还没有能够概括ALD全进程的实验模型，只能用不同的动物模型模拟ALD的部分病变，见总结示意Fig 1。本文综述了近年来有关ALD动物模型的研究进展[4-7]。应用这些动物模型不仅已被证明是研究ALD不同阶段发病机制的有用工具，还增强了对ALD中酒精性肝损伤及肝再生的信号通路等的认识，而且还将被药品监督管理部门批准用于新的药物治疗ALD的靶点研究。本文中，我们总结了目前常用的ALD动物模型的优缺点，重点介绍了有新进展的低浓度酒精蓄积-急性酗酒小鼠模型模拟急性酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)以及慢性酒精性肝纤维化(alcoholic hepatic fibrosis，AHF)小鼠模型，讨论了这些模型在研究ALD发病机制中的应用。

1急性酒精灌胃模型

这种模型采用简单的动物灌胃给予酒精的操作方法，最常用的酒精剂量是4～6 g·kg-1体重[8]。这种模型常用来研究酒精性肝损伤特别是急性发病的机制[7-8]。研究表明，急性酒精灌胃能明显影响肝线粒体功能，诱导氧化应激和炎症反应。尽管灌胃能够导致明显的炎症反应，但这种模型的缺点是：只能引起血清ALT和AST的轻度升高，限制了其的广泛应用。但是该模型对既往没有基础酒精蓄积，单纯一次性急性酒精损伤的机制研究具有很大的优势；特别在甄别和慢性酒精中毒导致的肝损伤不同的机制研究中非常有用。例如，有研究表明，急性酒精灌胃后的肝细胞可发生细胞自噬[7]，而慢性酒精性肝损伤并不能导致明显的自噬增加。

2慢性酒精喂养模型(Lieber-DeCarli 模型)

这种模型是酒精研究领域的著名专家Charles S. Lieber创立，是应用最为悠久和广泛的动物模型。最早期的动物慢性酒精喂养模型是通过在饮用水中直接添加酒精实现的，然而由于动物厌恶酒精的天性，造成动物脱水、血中酒精浓度过低和营养不良，更为明显的缺陷是直接喂饮含酒精的水并不能引起明显的肝损伤。因此，直接饮用含酒精水的动物模型很少应用于ALD发病机制的研究。为了克服这种模式的不足，Lieber博士的团队最早建立了一种动物液体饲料喂养模式，在液体饮食的基础上添加高浓度的酒精，克服了动物营养不良的缺点并且增加了酒精导致的肝损伤程度[9]。这种模型的优点为建模方法简单，使用商业化的粉末状饲料，按说明书方法加水配置成液态食物，临用前加所需浓度的酒精，每天更换1次以保持酒精浓度的稳定。该种液体饲料喂养模式已经被广泛用作研究ALD的动物模型。通过这种喂养方式4～12周，可模仿人类慢性饮酒模式，最终可导致小鼠肝脏轻度肝损伤、肝脂肪变性和轻微的肝脏炎症。相对于在饮用水中添加酒精的模型而言，慢性酒精液体饲料喂养模型的这些改进，使得它在相当长的一段时间内被认为是最适合应用于ALD早期阶段病变研究的最佳模型[7]。

虽然这种模型在直接饮用含酒精水模型基础上有重大进步，但仍存在以下缺点：慢性酒精液体饲料喂养只引起轻微肝损伤，即血清转氨酶的轻度升高、轻度肝脏脂肪变性、少量炎症而没有纤维化[7,10-11]。此外，这种模型也并没有完全规避了动物厌恶酒精的天性。表现在小鼠对酒精液体饲料的消耗量要比对照组小鼠的食物消耗量小。由于上述这些局限性的存在，促进了以下讨论的ALD动物模型的进展。

3胃内喂养模型(Tsukamoto-French模型)

为了克服动物厌恶酒精导致进食减少的缺陷，学者Tsukamoto建立了一种肠内连续喂养模式，通过手术放置肠内营养管，直接予以含酒精流质饮食和营养供给，可使得动物体内能够获得较高的血清酒精浓度[12-13]。这种模式最初用于大鼠[12]，后来亦用于小鼠[13]。这种喂养方式下的小鼠血清转氨酶水平明显增加，肝脏脂肪变性明显，有局灶性坏死和炎症病灶[12]。本模型的主要优点是在一定条件下能够诱导肝纤维化[14]，甚至和铁联用还可以导致肝硬化[15]。在此模型的基础上，研究者还尝试很多改进，试图增加肝损伤。French等[15]使用含有酒精的高脂饮食喂养，发现了在Wistar大鼠发生了明显的纤维化。进一步研究发现，与单纯酒精饮食相比，含羰基铁的高脂酒精饮食给Wistar鼠灌胃，与只用酒精饮食相比，其血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)增高了2倍，并且有小结节性肝硬化形成，这种加重的肝损伤与脂质的过氧化增加和铁有关[15]。最近，美国国立卫生院酒精滥用与成瘾研究所(NIAAA/NIH)的肝病实验室，本文作者亦参与的研究工作表明，高脂饮食的基础上给予一次性高浓度酒精灌胃，模拟人类的饮食习惯即长期高脂饮食加急性醉酒的生活方式，可引起严重的肝损伤，化学因子CXCL1在其中发挥重要作用，高脂饮食加急性酒精灌胃可引起肝脏和血清CXCL1的剧烈升高，进而吸引中性粒细胞迁移入肝脏引起炎症损伤[18]。

这种胃肠直接置管给予酒精液体饮食造成酒精性肝损伤的动物模型具有以下优点：不仅能够修改各种参数，如营养成分的组成等，尤为重要的是可以在动物体内保持一个较高的酒精含量，这样就能够为研究酒精与其他营养素或环境因素的共同作用提供一个较为理想的模型，为进一步研究ALD早期病变机制研究铺平了道路。然而，这种模型仍然存在技术难度大，动物饲养条件高等缺点。因为有侵袭性的手术，需对动物进行密切照顾防止并发症，需要有昂贵的配套设备，限制了其推广应用[12-13]。

4“二次打击”或“多次打击”模型

由于上述两种经典的ALD动物模型造成的肝损伤程度仍然不能达到人类ALD后期的严重的肝脏病变程度，很多科研工作者试图使用“二次打击”的酒精喂养模型去模仿晚期更严重的疾病阶段[16]。 “二次打击”模型的建立是基于以下理论基础：单纯酒精喂养大多情况下只能诱发脂肪变性，而这种脂肪病变是ALD后期严重病变的基础，如想达到更严重的损伤往往需要第二波打击即二次损伤。“第二波攻击”的方法包括营养成分修改、药物因素(如伴刀豆球蛋白A或四氯化碳)、激素、CYP诱导剂、TLR配体、基因操作(转基因或基因敲除)和病毒感染[16]。“二次打击”或“多次打击”模型对研究酒精性肝纤维化和肝炎特别有用，因为无论是肝纤维化还是明显的炎症都很难由单纯的慢性酒精诱导，但酒精加四氯化碳即可诱导明显的肝纤维化[17]。然而，这种 “二次打击”模型存在的缺点显而易见，由于“二次打击”中有非酒精因素的作用，因此，其结果可能与单纯酒精引起的机制和病理变化有一定的区别。所以，研究者在解释获得的研究结果时必须小心谨慎，因为很难确定研究数据是来源于酒精还是二次打击的因素引起。

5慢性酒精喂养加急性酒精灌胃模型(Gao-binge模型)

许多酒精性肝炎患者都有长期慢性饮酒史，最近有酗酒醉酒的病史。这一发病过程是之前任何ALD酒精喂养模型所不能模拟的。为了解决这一问题，作者在美国NIH/NIAAA工作时参与建立了一种新的慢性酒精积累加一次急性酒精灌胃酗酒的ALD模型，这一模型与人类的饮酒方式高度接近，可模仿临床上的慢性酒精依赖患者一次醉酒后酒精性肝炎的急性发作[5-6]。这种模型的建立方法简单：首先给予小鼠5 d的液体饮食适应期，然后接受10 d的5%～6%酒精液体饲料喂养，d 11早上给予一个高剂量酒精灌胃(5～6 g·kg-1体质量)，9 h后处理动物，取血、肝脏标本。这一模型的优点有：可模拟人酒精性肝炎的发病过程，血清ALT水平明显升高、肝脏有较严重的脂肪变性和炎症，肝脏中性粒细胞浸润明显，血清中酒精浓度较高[5,19]。目前，这个模型已经开始广泛推广应用[20-21]。这个模式的喂养方案还可以将慢性酒精喂养的时间延长至8～12周，然后给予一次高剂量的酒精灌胃，可产生更严重的肝损伤(待发表)。

这种Gao-binge模型与以往经典的Lieber-DeCarli 和Tsukamoto-French模型相比，能够诱导产生更高水平的脂肪变性、血清ALT和肝脏炎症反应(Tab1)[5-6]。Gao-binge模型另外一个重要特点是中性粒细胞浸润明显[1,5-6,19]，而其他慢性酒精喂养模型的损伤与肝的巨噬细胞浸润有关[7-8,12-13,16]。中性粒细胞标记的Ly6的肝表达和MPO阳性细胞的数量在慢性酒精喂养之后保持不变，但在Gao-binge模型中明显升高了[19]。E-选择素表达上调对中性粒细胞的浸润有协同作用[19]。目前，已有学者通过Gao-binge模型研究急性酒精性肝损伤的新机制及ALD治疗的新靶点。Bin Gao实验室除了发现的E-选择素在ALD中的关键作用外，还探讨了白介素-22在Gao-binge模型中对ALD的保护作用[22]。最近，该实验室利用该模型检验了糖皮质激素泼尼松龙在治疗酒精性肝损伤中的作用[23]。泼尼松龙用于急性酒精肝的治疗已经40多年，但结果有喜有忧，泼尼松龙表现出能加剧由Gao-binge模型或四氯化碳诱导的肝炎[23]。泼尼松龙的有害作用是因为它能够抑制肝再生和影响中性粒细胞与巨噬细胞的吞噬作用。这些结果表明，泼尼松龙可能不适合用于肝毒素诱导的肝损伤的治疗；相反，它能够改善由刀豆蛋白A诱导的T/NKT细胞介导的免疫性肝炎[23]。

6慢性酒精性肝病和肝纤维化模型

重度酒精依赖病人长期大剂量饮酒，且有反复多次酗酒醉酒史，呈现醉酒-恢复-醉酒模式。作者一直试图建立一种慢性酒精肝损伤再生模型以模拟这类病人，进而利用动物模型研究其发生机制。此外，到目前为止仍然缺乏单纯酒精引起的慢性酒精性肝纤维化模型，特别是小鼠。我们课题组已在大鼠上初步建立了酒精性肝纤维化模型[24-25]，但仍需要和国际通用的液体饲料喂养接轨，建立规范的实验流程，该项工作正在进行中。作者建立的慢性酒精性肝炎模型的方法：在一直给予低浓度乙醇(5%)的流质喂养的基础上，给予每周2次的高浓度酒精(30%)灌胃(5～6 g·kg-1体重)，一共8～12周。这种方法的小鼠死亡率较高，限制了更多酒精的给予和更重小鼠酒精性肝损伤的诱导。该模型与Gao-binge模型比较，血清转氨酶水平反而下降，肝脏脂肪变更为严重，肝脏中中性粒细胞浸润更为弥散，机制与氧化应激有关。在成年小鼠(3月龄)并不能诱导出明显的肝脏纤维化病理改变，仅仅有与纤维化反应有关的mRNA表达增加。然而，令我们感兴趣的是在老年小鼠(12～16月龄)，同样的酒精处理方式(5%酒精喂饲/天+5 g·kg-1灌胃2次/周)8～12周后在肝脏形成了典型的酒精性肝纤维化改变(“chicken wire” fibrosis，鸡笼样纤维化)。上述结果提示使用12月龄的小鼠，给予慢性酒精积累加多次高剂量酒精灌胃可以建立酒精性肝纤维化小鼠模型。目前，作者正利用该模型研究酒精性肝纤维化产生机制。

与小鼠相比较，大鼠对酒精的耐受性更好，国内有科学工作者采用以下方法对大鼠进行酒精灌胃饲养：即随着饲养时间的延长而不断加大酒精剂量，具体方法是，1～4周的酒精饲养剂量为5 g·kg-1体重/天，然后，从5～8周开始，剂量上升到7 g·kg-1体重/天；9～12周剂量为9 g·kg-1体重/天；最后，从13～24周剂量为9.5 g·kg-1体重/天[25]。通过这种递增式的高浓度长时间酒精灌胃，比较容易诱导急性肝损伤，同时可以诱导较为严重的酒精性肝纤维化[26]。

7结论与展望

综上所述，ALD的动物模型按疾病进程阶段分类见Fig 1。一次性酒精灌胃模型可引起轻微的血清转氨酶升高，肝脏有炎症反应。Lieber-DeCarli模型只能诱导轻度脂肪肝，轻度升高的血清转氨酶，非常轻微的肝脏炎症。Tsukamoto-French模型可引起较为严重的脂肪肝、肝脏炎症和损伤，但复杂的操作和对动物房的严格要求限制了其推广。Gao-binge模型能诱发更严重的肝脂肪变性、肝细胞损伤和肝中性粒细胞的浸润。慢性酒精积累加多次高剂量酒精灌胃可模拟真正意义的慢性酒精性肝病的病变，使用老年小鼠还可以建立酒精性肝纤维化模型。到目前为止，仍然缺乏单纯酒精造成的酒精性肝癌的动物模型。这些模型能被用于探索不同阶段或不同严重程度的ALD的发病机制，为发现有潜在治疗ALD药物新靶点提供研究工具。

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Animal models of alcohol liver diseases

ZHOU Heng1,2, LI Jun1,3, WANG Hua1,2,3

(1.CollegeofPharmacyofAnhuiMedicalUniversity, 2.DeptofOncology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity, 3.InstituteforLiverDiseasesofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Key words:alcoholic liver diseases; animal models; fatty liver; liver injury; inflammation; fibrosis

Abstract:Chronic alcohol consumption is a leading cause of chronic liver diseases worldwide, resulting in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Almost all heavy drinkers develop fatty liver, but only 20%～40% of them develop more severe forms of alcoholic liver diseases such as alcoholic hepatitis and alcoholic fibrosis, and the underlying mechanisms that contribute to the disease progression remain largely unknown. The animal models which can mimic human alcoholic liver diseases are very necessary tools for better understanding and exploring the therapy strategy of the disease. Currently, the most widely used models for alcoholic liver injury are Lieber-DeCarli model, Tsukamoto-French model, Gao-binge model and others. Here we summarize the recent advances in animal models recapitulating different features and etiologies of human alcoholic liver diseases. These animal models will be very useful for the mechanism study of alcoholic liver diseases and further new therapeutic drug screening.

收稿日期:2015-12-01,修回日期:2016-02-02

基金项目：国家自然科学基金优秀青年基金项目(81522009/H0317)；新世纪优秀人才支持计划(No NCET-13-0644)；安徽省皖江学者计划资助。

作者简介：周恒(1988-)，男，硕士生, 研究方向：肝脏药理学，E-mail:912358033@qq.com; 王华(1978-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：肝脏药理学，通讯作者，E-mail: wanghua@ahmu.edu.cn； 李俊(1960-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：药理学，通讯作者，Tel: 0551-65161001，E-mail: lijun@ahmu.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.006

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0468-05

中国图书分类号：R-05；R322.47；R363-332；R575

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.012.html