抗PSMA膜外域单克隆抗体的制备及初步应用①

陶　嵘　倪振华　阳　圣　刘　冲　朱　敏　沈江帆　涂少华

(上海市中医药大学附属普陀医院，上海200062)

抗PSMA膜外域单克隆抗体的制备及初步应用①

陶嵘倪振华阳圣刘冲朱敏沈江帆涂少华②

(上海市中医药大学附属普陀医院，上海200062)

[摘要]目的：制备抗PSMA膜外域单克隆抗体。方法：应用生物信息技术预测PSMA膜外域多肽抗原片段，原核表达，免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备抗PSMA膜外域单克隆抗体，亲和层析纯化和Western blot及ELISA鉴定，并用于前列腺癌动物模型放射免疫显像。结果：经软件分析，获得含310aa序列特异性强的膜外域抗原片段，免疫、融合后，经过ELISA筛选获得到3株阳性杂交瘤细胞株(5E6、4A5和4D7)，亚型鉴定结果为5E6、4A5为IgG2a，4D7为IgG1，腹水型抗体效价均在1∶256 000以上；Western blot结果表明，所制备的单克隆抗体均可与PSMA膜外域抗原特异性结合，竞争抑制ELISA试验显示制备的单抗与重组抗原及标准抗原PSMA能竞争结合。动物模型放射免疫显像结果进一步证实，制备的单克隆抗体在动物体内能与PSMA 膜外域抗原特异性结合，并使肿瘤显像。结论：制备的抗PSMA膜外域单克隆抗体能特异性识别PSMA抗原，为前列腺癌的免疫诊断及免疫治疗奠定了基础。

[关键词]前列腺特异性膜抗原(PSMA)；单克隆抗体；前列腺癌

前列腺特异性膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)是前列腺上皮细胞膜的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，共750个氨基酸残基，由三个结构域组成，分别是含19个氨基酸的胞内域，含24个氨基酸的跨膜域和含707个氨基酸的胞外域，是一种比前列腺特异性抗原(PSA)更敏感、更特异的前列腺癌肿瘤标志物[1，2]。在前列腺癌，特别是非雄性激素依赖性前列腺癌及转移灶中呈高表达，而在前列腺外正常组织仅少量表达，具有很高的组织特异性，因此成为前列腺癌靶向诊断及治疗研究中一种比较理想的靶蛋白[3]。1987年，Horoszewicz等[4]首先将前列腺癌细胞株LNCaP的细胞膜成分分离出来，用其免疫小鼠筛选出一株单克隆抗体7E11-C5，该抗体与LNCaP前列腺癌细胞膜发生反应，是最早的抗PSMA单克隆抗体，随后应用放射性核素标记抗PSMA单克隆抗体(7E11-C5.3)进行放射免疫显像以早期发现转移癌和复发癌，在前列腺癌的诊断、临床分期、复发及监测方面显示了良好的应用价值[5，6]，但存在一定的局限性：由于单克隆抗体(7E11.c5)结合位点在前列腺癌细胞的胞内氨基端，对于细胞膜完好的癌细胞，单克隆抗体不能进入与之结合，这严重影响了7E11.c5的使用效果，因此，制备针对PSMA胞外域的特异性单克隆抗体，有望：①克服抗体7E11.c5与PSMA抗原结合的局限性，提高前列腺癌免疫显像的灵敏度；②除了能进行前列腺淋巴结等软组织显像外，还有望用于骨转移显像；③通过标记发射β射线的核素，还有望用于前列腺癌的放射免疫治疗。本研究应用生物信息技术和原核表达技术预测并表达PSMA膜外域多肽抗原片段，用表达的多肽抗原，免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备抗PSMA膜外域单克隆抗体，并应用此抗体进行前列腺癌动物模型显像，为前列腺癌靶向诊断及靶向治疗奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株、实验动物小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)，由上海生物工程公司提供；6～8周龄雌性BALB/c小鼠，由上海第一人民医院动物实验中心提供。前列腺癌细胞株：PSMA阳性前列腺癌LNCaP细胞株和PSMA阴性前列腺癌细胞株PC3(中科院上海细胞生物研究所)；实验动物：BALB/c-nu/nu雄性裸鼠(中国科学院上海药物研究所，许可证号[SCXK(沪)2004-0002]，鼠龄4~6周，体重18~25 g。

1.1.2主要试剂RPMI1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司；8-氮鸟嘌呤、HT、HAT、PEG、弗氏完进行全佐剂、弗氏不完全佐剂、PSMA标准抗原均购自Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司;注射用MDP药盒(北京欣科思达医药科技有限公司)、Na99TcmO4(上海原子科兴药业有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1PSMA膜外域多肽抗原的预测及表达载体的构建PSMA膜外域多肽抗原预测：根据NCBI GenBank中报道的PSMA(Gen Bank：AAA60209.1)一级结构信息[7]，采用ExPASy、Protean 和Blastn 等软件对PSMA膜外域氨基酸序列进行亲水性、抗原指数及同源性分析，筛选亲水性好、抗原性强，同源性低的氨基酸序列为多肽抗原序列，确定PSMA 膜外域C端的310个氨基酸(aa440~750)为本次要表达的PSMA膜外域抗原片段，针对原核表达宿主，对预测的PSMA膜外区多肽基因序列进行偏爱密码子优化设计后，由上海生物工程公司进行全基因合成，并插入到pET-32a载体上，插入位点为KpnⅠ和XhoⅠ。原核表达载体的构建：对目的基因和表达载体(pET-32a)分别进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，胶回收酶切产物。将酶切后的目的片段和质粒室温连接后转化到DH5α菌株中。挑取转化后平板上的单菌落于试管中37℃、220 r/min培养过夜，抽提质粒，KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，并将重组质粒送测序鉴定，测序正确的重组质粒，命名为pET-32a-r-ectodomain-PSMA。

1.2.2目的蛋白的表达与鉴定构建好的pET-32a r-ectodomain-PSMA表达载体转化到表达菌株BL21(DE3)中，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达，设定表达温度为15℃、25℃、37℃，诱导时间分别为15℃过夜、25℃过夜、37℃ 5 h，诱导结束后终止表达，离心收集菌体，超声破碎后进行SDS-PAGE电泳鉴定。然后使用镍离子亲和层析，对目的蛋白纯化。

1.2.3单克隆抗体制备及纯化将纯化的目的蛋白免疫3只BALB/c小鼠。初次免疫使用重组抗原与弗氏完全佐剂等体积混合，背部多点注射免疫(50 μg/只)。后期免疫均用重组抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合，腹腔冲击免疫(50 μg/只)。每隔两周免疫一次，免疫三次。在准备细胞融合前3 d小鼠腹腔再冲击免疫一次(100 μg/只)。阳性克隆筛选：选取效价最高的小鼠脾细胞，按SP2/0细胞与脾细胞1∶10比例融合，采用间接ELISA法对融合细胞培养上清进行检测，筛选阳性克隆株，方法如下：以重组表达的PSMA胞外域多肽抗原包板(50 μl/孔，5 μg/ml)4℃，过夜，用0.05% PBS-Tween 20洗二次，2% BSA每孔300 μl 37℃封闭45 min,再洗二次，每孔加100 μl稀释1 000~5 000倍的培养上清液或腹水，37℃温育1 h，洗5次，加入1∶400稀释HRP-羊抗鼠IgG,37℃温育1 h,洗5次，TBM溶液显色，以2 mol/L硫酸50 μl终止反应，以酶联检测仪测定450 nm光密度OD450。单克隆抗体的大量制备及纯化：将BALB/c小鼠预注射500 μl不完全佐剂，7 d后，每只小鼠注射约106阳性克隆细胞，每天观察小鼠腹部变化，待小鼠腹部胀大，收集腹水，离心弃沉淀，先用饱和硫酸氨粗提，用pH7.4 PBS透析，再使用protein A/G-Plus Beads抗体纯化柱(上海悦克生物科技)纯化抗体。方法如下：待纯化的腹水先用0.45 μm的滤膜过滤，调节pH值至7.5，然后过protein A 柱进行亲和层析纯化，洗脱液用0.1 mol/L甘氨酸缓冲液pH2.7，洗脱下来的纯化抗体再用pH7.5 PBS透析过夜。

1.2.4单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚型鉴定采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Bio-Rad)鉴定单克隆抗体的型及亚型，方法如下：首先，用TBS缓冲液将腹水或杂交瘤培养液1∶50 000稀释，取稀释抗体50 μl包板(8孔条)，其次，将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM，每孔50 μl各加一条，室温温育1 h，洗板3次，每孔加75 μl TMB底物，室温温育10 min,每孔加75 μl终止液，于450 nm波长读数。

1.2.5单克隆抗体效价测定采用间接ELISA法(方法同克隆筛选)测定单抗效价。

1.2.6单克隆抗体的Western blot鉴定将纯化的PSMA抗原进行15% SDS-PAGE，转膜后5%脱脂奶粉封闭过夜，以制备的抗PSMA膜外域单抗为一抗(1∶10 000)，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗(1∶300)，TMB底物显色，出现条带时终止反应。

1.2.7单克隆抗体的ELISA鉴定竞争抑制试验：将纯化的重组PSMA抗原用包被稀释液稀释后(终浓度4 μg/ml)包被酶标板，每孔100 μl，4℃孵育过夜，用洗涤液洗3次。每孔加入封闭液200 μl，37℃封闭1 h，用洗涤液洗3次。将标准抗原PSMA用稀释液制备成64、32、16、8、4、2、0 μg/ml七种浓度，每种浓度加2孔，每孔加辣根过氧化物酶标记的抗PSMA单克隆抗体5E6 50 μl，37℃孵育40 min,用洗涤液洗5次，加入底物100 μl，避光显色15 min,加终止液50 μl，用酶标仪(450 nm)测定各孔OD值，绘制抑制曲线。

1.2.8单克隆抗体的放射免疫显像前列腺癌动物模型的建立：将PSMA阳性的LNCaP细胞株进行培养，取对数生长期的LNCaP细胞进行消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度接近于1×108个/ml，接种0.2 ml于BALB/c祼鼠的右侧后背部皮下，待肿瘤生长至直径约1 cm时，作为实验鼠用于SPECT显像；用PSMA阴性的PC3细胞建立的移植瘤作为对照。单克隆抗体的放射性标记：采用直接标记法[8]进行标记:在360 μg 5E6单克隆抗体中加入10 μl 2-巯基乙醇，摇匀，30℃放置30 min，即为还原抗体，用2 ml生理盐水溶解MDP药盒，取40 μl加入还原抗体中，再加入100 μl Na99Tcm04 (约370 MBq),室温下振荡15 min，即为标记抗体混合物，采用Sephadex G50柱层析纯化获得99Tcm-5E6抗体。单克隆抗体的放射免疫显像：实验鼠和对照鼠经静脉注射纯化的99Tcm-5E6(25 μg/只，约6.2~8.5 MBq)，2 h和6 h后分别进行SPECT显像，显像过程中，裸鼠用1.5%的异氟烷吸入麻醉，固定在SPECT扫描器的中央，用白炽灯照射裸鼠，维持裸鼠体温37℃左右。显像条件，配针孔式准直器，能峰140 kev，窗宽20%，矩阵256×256，采集时间5 min。

2结果

2.1重组质粒pET-32a-PSMA酶切鉴定重组质粒经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切，电泳显示在相应位置出现条带，与预期大小一致(见图1)，表明重组质粒构建成功。

2.2PSMA膜外段多肽的鉴定与纯化不同表达条件下目的蛋白表达见图2，三种表达条件目的蛋白均有表达，25℃过夜目的蛋白表达量最多。利用标签蛋白6×His对目的蛋白纯化见图3，收集经500 mmol/L咪唑洗脱下来的蛋白进行复性，浓缩备用。

2.3ELISA筛选及抗体效价测定小鼠脾细胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后，共铺5块细胞96孔培养板，10 d左右取细胞上清经间接ELISA方法测定OD450nm值，选取其中阳性值最高的进行亚克隆筛选。经亚克隆筛选，共获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5E6、4A5和4D7。ELISA法测定三株抗体的效价均在1∶25 6000以上。

2.4单抗的免疫球蛋白类型鉴定三株单克隆抗体均属IgG型，其中，4D7属IgG1亚型，5E6和4A5属IgG2a亚型，见图4。

2.5单抗的Western blot鉴定以300 ng重组蛋白上样，待检的抗PSMA膜外域单抗为一抗，HRP-羊抗小鼠IgG为二抗，进行Western blot检测，结果如图5。

2.6单抗的竞争抑制ELISA鉴定以重组抗原包板，以单克隆抗体5E6标酶，用标准抗原PSMA竞争抑制，重组抗原与标准抗原均能同制备的单克隆抗体5E6特异性结合并存在竞争抑制关系，竞争抑制曲线见图6。

2.7动物模型放射免疫显像SPECT显像显示：实验组，99Tcm-5E6抗体注射后2 h，肿瘤部位可见放射性浓聚，注射后6 h，肿瘤部位出现明显的放射性浓聚，而对照组，在注射99Tcm-5E6抗体2 h、6 h后，肿瘤部位始终未见明显的放射性浓聚，见图7。

3讨论

前列腺癌雄激素去势治疗是初诊前列腺癌的标准治疗，但经过中位治疗时间14~30个月后，几乎所有患者都将进展为去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)，其生存期明显缩短，预后不佳[9,10]。近年来研究表明，以人前列腺特异性膜抗原(PSMA)膜外域为靶标的单克隆抗体对CRPC治疗及前列腺癌转移的探测具有一定效果[11,12]。可靠、稳定来源的抗PSMA膜外域单克隆抗体是前列腺癌免疫诊断及治疗的关键。

单克隆抗体的制备有杂交瘤和基因工程两大类方法，前者成熟、稳妥，但繁琐耗时；后者简便快速，但获得的抗体亲和性稍差，临床应用受到一定影响，因此仍选传统的杂交瘤技术制备单抗。单抗的制备抗原的选取是关键，由于抗体对抗原的识别，不是对抗原整个分子的识别，而是通过对抗原上的抗原表位进行识别，达到对抗原的特异性识别[13]。对于蛋白质抗原，并不一定需要表达全长蛋白作为免疫抗原，蛋白质N端或C端的300~400个左右的氨基酸是经常选择的抗原片段。应用生物信息技术预测PSMA膜外域抗原表位，并对预测的PSMA膜外域水溶性好、抗原性强、特异性高的区域作为表达对象，此区域位于PSMA膜外域C端的aa440-aa750，共310个氨基酸进行原核表达。

对PSMA膜外域C端的310个氨基酸进行全序列基因合成，接入表达载体pET-32a中，构建表达载体pET-32a-r-ectodomain-PSMA。经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切后电泳显示在相应位置出现目的条带，与预期大小(930 bp)相符，表明成功构建了重组质粒。重组蛋白表达后经镍离子亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳分析，纯化蛋白大小约50 kD与理论结果相符。将制备的目的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠，筛选出3株分泌抗人PSMA膜外段单克隆抗体的细胞株5E6、4A5和4D7。体外能稳定传代，细胞培养上清抗体效价稳定在1∶256 000以上。制备的单抗经鉴定均为IgG型，其中5E6、4A5为IgG2a亚型，4D7为IgG1亚型，Western blot结果显示在50 kD处有特异性条带，说明制备的三株单克隆抗体均能与重组蛋白特异性结合。竞争抑制ELISA试验，重组抗原与标准PSMA抗原均能与单抗5E6竞争抑制性结合，进一步验证了所制备单抗的特异性。

单克隆抗体放射免疫显像结果显示：99Tcm-5E6在裸鼠体内能特性结合PSMA阳性的前列腺肿瘤细胞，对前列腺肿瘤具有定位性能，在注射示踪剂2 h、6 h后，肿瘤部位出现明显的放射性浓聚，并使肿瘤初步显像；而在PSMA阴性的对照组，99Tcm-5E6未能与肿瘤细胞结合，在肿瘤部位未见明显的放射性浓聚。 因此，本研究应用生物信息技术和原核表达技术预测并表达PSMA膜外域多肽抗原片段，所制备的抗PSMA膜外域单克隆抗体能与动物模型体内活的前列腺肿瘤细胞抗原结合，具有较高的特异性。本研究建立了一套可靠、稳定的抗PSMA膜外域单克隆抗体制备方法，为前列腺癌靶向诊断及靶向治疗奠定基础。

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[收稿2015-06-05修回2015-09-15]

(编辑倪鹏)

Preparation and preliminary utilization of monoclonal antibodies specifically against an immunogenic fragment in ectodomain of prostate-specific membrane antigen (PSMA)

TAORong,NIZhen-Hua,YANGSheng,LIUChong,ZHUMin,SHENJiang-Fan，TUShao-Hua.PutuoHospital,ShanghaiUniversityofChineseTraditionMedicine，Shanghai200062,China

[Abstract]Objective:To prepare monoclonal antibodies specifically against an immunogenic fragment in ectodomain of prostate-specific membrane antigen (PSMA).Methods: An polypeptide immunogenic fragment in the ectodomain of PSMA was predicted by biological information technology,and then it was expressed prokaryotically.BALB/c mice were immunized with the prokarytically expressed recombinant polypeptide antigen,to prepare the monoclonal antibodies specifically against an immunogenic fragment in ectodomain of PSMA by hybridoma technology,purification of monoclonal antibody by affinity chromatography,characterization of the monoclonal antibodies by Western blot.The radioimmunoimaging in prostate cancer model was performed by using the labeled McAb.Results: Throught the software analysis,we got the antigen fragment in the ectodomain of PSMA containing 310aa sequences higher specificity,artificially synthesized gene sequence of the region,and constructed a prokaryotic expression vector pET-32a-r-ectodomain-PSMA,by prokaryotic expression we obtained the 50 kD target antigen,after hybridization,the three positive hybridoma cell lines (5E6,4A5 and 4D7) were selected by ELISA using target antigen,the isotypes of 5E6 and 4A5 were IgG2a,the isotypes of 4D7 were IgG1,the titer of three monoclonal antibodies was above 1∶256 000.Western blot results showed that the prepared monoclonal antibodies could binding specifically to the antigen in the ectodomain of PSMA.Radioimmunoimaging in prostate cancer animal model results further confirm that the prepared monoclonal antibodies could combinate with the antigen in the ectodomain of PSMA in the animal body,and make the tumor imaging.Conclusion: The prepared monoclonal antibodies can specifically recognizes the PSMA antigen,which laid the foundation for the immunodiagnosis and immunotherapy of prostate cancer.

[Key words]Prostate specific membrane antigen (PSMA);Monoclonal antibody;Prostate cancer

作者简介：陶嵘(1964年-)，男，科主任，副主任医师，主要从事分子影像学方面研究,E-mail:13801703538@163.com。

通讯作者②，E-mail:tush_99@163.com。

中图分类号R392
①本文为上海中医药大学附属普陀医院院级课题(No.2013GQ014Ⅱ)。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0205-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.013

·免疫学技术与方法·