口服灭活幽门螺杆菌对新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保护作用研究

杨钰欣　江吉富

(遵义市妇幼保健院，遵义563000)

口服灭活幽门螺杆菌对新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保护作用研究

杨钰欣江吉富

(遵义市妇幼保健院，遵义563000)

[摘要]目的：探索BALB/c小鼠新生期口服灭活幽门螺杆菌(H.pylori)后对胃黏膜是否具有免疫保护作用。方法：将32只BALB/c小鼠分为四组进行实验。第Ⅰ组为PBS对照组，第II组为灭活H.pylori组，第Ⅲ组为灭活H.pylori加大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)组，第IV组为正常对照组。用相应抗原成分对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组出生24 h以内的新生BALB/c小鼠进行灌胃免疫，末次免疫两周后，将小鼠用108CFU的幽门螺杆菌SS1株进行活菌灌胃攻击，连续攻击两天，每天两次。在攻击后的第28天，将各组小鼠处死，取胃组织进行活菌计数及组织病理学炎性评分。结果：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组慢性炎症评分分别为2.25±0.46、2.12±0.35、1.5±0.53、0.25±0.46，炎症活动度评分为2.12±0.35、2.12±0.35、1.37±0.52、0.25±0.46；除Ⅰ、Ⅱ组间无统计学意义外，其余组间差异均有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组细菌定植量分别为1.33±0.21、1.18±0.27、1.05±0.37×105CFU/1个胃，Ⅳ组细菌定植量<4×102CFU/1个胃，低于检测值，Ⅲ组的细菌计数低于Ⅰ、Ⅱ组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：BLAB/c小鼠新生期给予灭活幽门螺杆菌加LTB灌胃免疫与活菌攻击后炎症的减轻和细菌定植量的减少可能相关，具有一定的免疫保护作用。

[关键词]灭活幽门螺杆菌；LTB；新生BALB/c小鼠；免疫保护

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)在1979年被澳大利亚学者Warren和Marshall发现，于1982年成功地从人胃黏膜中分离培养出来，并证实了该细菌的感染与胃炎相关。1983年，他们的这一成果发表在Lancet杂志上[1]。幽门螺杆菌感染在全世界广泛流行，日本的一项研究显示，H.pylori的暂时定植可能在新生儿期就有出现[2]。虽然儿童患消化性溃疡并不多见，但与儿童慢性胃炎、消化不良、慢性腹泻和复发性腹痛等的发病密切相关[3]。实验证明有效的疫苗接种能够防止H.pylori的感染[4]。一种用福尔马林灭活的H.pylori全菌体冻干疫苗辅以LT的双突变佐剂给予BALB/c小鼠灌胃免疫，结果证明具有良好的免疫保护反应[5]。本课题的前期研究表明，对出生 24 h内新生BALB/c小鼠用灭活幽门螺杆菌加大肠杆菌不耐热肠毒素——LTB进行灌胃免疫后，能诱导机体产生免疫反应[6]。而这种免疫反应是否具有保护作用尚不明确，所以本实验的主要目的在于探索口服灭活幽门螺杆菌疫苗对新生期小鼠胃粘膜炎症变化的影响，希望能为人类新生期接种H.pylori疫苗的可行性作一铺垫。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂与仪器哥伦比亚琼脂培养基、H.pylori培养选择性添加剂购自英国OXIOD公司；布氏肉汤购自杭州天和有限责任公司；三元混合气体(O2、CO2、N2)购自贵阳申建气体有限责任公司；LTB购自Sigma公司；恒温培养箱(DHP-9272)购自上海一恒有限责任公司。

1.1.2 菌株灭活幽门螺杆菌NCTC 11637(活菌购自中国疾病预防控制中心传染病防治研究所。培养后经本室灭活制成终浓度为2×109ml-1的H.pylori灭活菌液，4℃保存备用)[6]。幽门螺杆菌SS1株(由中国疾病预防控制中心馈赠)。

1.1.3动物模型BALB/c小鼠(购于中国药品生物制品检定所)，清洁级，雌雄兼用，自由饮水，分笼饲养。

1.2方法

1.2.1免疫方案根椐不同的免疫剂型将小鼠分为四组(如表1所示)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为实验组(8只/组)，Ⅳ组为正常对照组(8只/组)。用H.pylori灭活全菌体与已经溶解的LTB对各组BALB/c小鼠进行灌胃免疫，免疫时间为出生后第0(24 h内)、7、21天。第0天免疫时，将24 h以内出生的BALB/c小鼠与母鼠分离3 h后，进行灌胃，灌胃完毕，继续放入笼中(与母鼠隔离)，4 h后，再次按照上述方法给予第二次灌胃，免疫结束2 h后，将母鼠放回笼中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，与母鼠隔离6 h，免疫方法同前，免疫2 h后放回母鼠笼中。

表1实验分组

Tab.1Group of experiment

第21天免疫前断食24 h，断水4 h后进行灌胃免疫，2 h后恢复食水。正常对照组正常喂养，不进行任何处理。

1.2.2攻击前准备将哥伦比亚血琼脂培养基上培养第三天的H.pylori SS1株刮取一环，接种到含30 ml氏肉汤的三角烧瓶里，灌入混合气体，置37℃水平振荡培养150次/min，培养 48 h后，取菌悬液涂片革兰染色镜检，观察是否有杂菌生长，菌体形态是否改变；通过动力实验观察动力是否良好。如观察结果正常，收集菌悬液，5 000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入PBS使其再次悬浮，放入37℃孵箱10 min，使其恢复动力后，用比浊仪测定并用PBS调整至攻击所需浓度；攻击菌液为每次攻击前用新鲜培养物配制。

1.2.3攻击方法末次免疫两周后，将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠用H.pylori SS1株进行活菌攻击，108CFU/0.2 ml/次，每天灌胃2次，两次攻击中间隔6 h，连续2 d。攻击前断食12 h，断水4 h，用50 μl 3%NaHCO3中和胃酸，20 min以后进行活菌攻击，每日末次攻击2 h后恢复饮食。正常对照组正常喂养，不进行任何处理。

1.2.4胃组织炎性检测将活菌攻击后28 d的各组小鼠及与其年龄相同的正常对照组小鼠同时进行脱椎脊处死，用碘酒、酒精彻底消毒整个腹部，然后用无菌剪刀将其剪开，从贲门到幽门处剪取胃，置无菌平皿内，沿胃大弯剖开，平均分成两半，一半用于组织病理学检测，用无菌棉拭子轻轻去除胃内容物，在蒸馏水中轻轻漂洗后，放入盛有10%福尔马林的小瓶内固定，送病理科进行石蜡切片并行HE染色、瑞氏吉姆萨染色观察小鼠在活菌攻击后胃部的炎症改变，另一半用于H.pylori培养，了解细菌定植量；高倍镜下观察10个视野固有层淋巴细胞及中性粒细胞的浸润情况，判断炎症程度。评分方法如下：慢性炎症评分：0分：固有层偶见淋巴细胞浸润；1分：固有层散在淋巴细胞浸润；2分：固有层有中等量淋巴细胞浸润；3分：固有层大量淋巴细胞浸润，个别在胃粘膜下有淋巴滤泡形成[7]。炎症活动度评分：0分：固有层偶见中性粒细胞浸润；1分：固有层散在中性粒细胞浸润；2分：固有层有中等量中性粒细胞浸润；3分：固有层有大量中性粒细胞浸润。

1.2.5H.pylori定植量检测按照上述操作，将余下的另一半胃组织放入无菌EP管内，加入100 μl布氏肉汤，用剪刀剪碎组织，再加入1 900 μl布氏肉汤，混匀后，倒入事先准备好的无菌玻璃匀浆器内进行充分匀浆，然后将组织匀浆液分别做1∶10，1∶100，1∶1 000稀释，分别接种100 μl到含H.pylori选择性添加剂的哥伦比亚血琼脂内，用倾注法培养后进行菌落计数，最后将平皿置培养罐内，充入混合气体，37℃培养5~7 d，观察菌落，进行涂片染色镜检、触酶、氧化酶及快速脲酶试验并计数。

2结果

2.1活菌攻击后胃组织炎症评分将各组BALB/c小鼠采集的胃组织标本进行炎症评分，从图1中可以看出Ⅲ组的炎症评分明显低于Ⅰ、Ⅱ组，说明使用灭活H.pylori与LTB共同免疫小鼠后，能降低H.pylori攻击后对胃组织的病理损伤作用，结果显示具有统计学意义(P<0.05.( 如图1 所示) 。Ⅰ、Ⅱ组病理切片中固有层可见大量淋巴细胞与中性粒细胞浸润( 如图2) 。Ⅲ组的病理切片中亦有不同程度的炎性反应，但评分低于Ⅰ、Ⅱ组。

2.2活菌攻击后H.pylori定植量检测(表2)从表2中可以看出Ⅲ组的活菌定植量低于Ⅰ、Ⅱ组，说明使用灭活H.pylori与LTB共同免疫小鼠后，能减少活菌攻击后的H.pylori体内定植量，结果具统计学意义(P<0.05)。

Note：Compared with groupsⅠandⅡ,1)P<0.05.

3讨论

早在90年代初期，有关H.pylori疫苗的研究就已经开始。近年来，有着较多关于H.pylori疫苗的研究。根据疫苗的构成不同，可将其分为全菌疫苗、亚单位疫苗、表位疫苗、载体疫苗等。亚单位疫苗的结构与组成较为明确，是可引起免疫保护的一类蛋白质、脂多糖等微生物组分。与亚单位疫苗相比，全菌疫苗的优点是能诱发针对细菌各种抗原的免疫应答[8]。但是这些蛋白介导的免疫应答机制仍然不十分清楚，另一方面，现在仍然不能确定对H.pylori整个菌体有效的理想疫苗，与其诱导的免疫应答的效应因子是什么(例如抗体、CD4+亚群、细胞因子等)。虽然目前的研究成果没能达到人们的期望值，但致力于H.pylori疫苗各个方向的研究人员都在不断的努力。该疫苗的研究成果在中国较为领先，Zeng等[9]用重组H.pylori疫苗对6~15岁儿童进行口服免疫，结果显示服疫苗组能降低H.pylori的感染率。在国外，Nedrud等[10]用重组的CTA1-UreB3T-DD疫苗对BALB/c小鼠给予鼻黏膜免疫后，亦产生了良好的免疫反应并减少了H.pylori的定植。但他们的实验对象多为成年鼠、成人或儿童。

我们将新生BALB/c小鼠作为实验对象，因为调查结果再次证实部分H.pylori的感染在幼儿期就已存在[11]。我们希望通过对新生婴儿进行疫苗接种后，达到能在早期预防H.pylori感染的目的。本次实验结果显示，在活菌攻击后，各组均有不同程度的炎症反应。PBS组的炎性反应较明显，多数胃黏膜固有层及黏膜下层可见较多淋巴细胞与中性粒细胞的浸润。灭活H.pylori加佐剂组的炎症评分结果低于Ⅰ、Ⅱ两组，提示BALB/c小鼠在新生期口服灭活H.pylori与LTB后能一定程度地降低活菌攻击后胃黏膜的炎性反应，但与正常对照组比较还存在一定差异。活菌定植量检测所得出的实验结果显示，灭活H.pylori加佐剂组在活菌攻击后的细菌定植量与前两组比较，结果具有统计学意义。提示该组抗原成分能刺激机体产生黏膜免疫应答来减少细菌的定植。虽然初步的实验结果令人兴奋，但还存在着许多待解决的问题。由于粘膜免疫的特殊性，我们需要一种对胃粘膜具有高免疫原性的疫苗来预防H.pylori 的感染，这包括对抗原与佐剂设计，免疫方法及途径的进一步探索；我们还需要在新生期机体免疫机制方面进行更深层次地研究。

参考文献：

[1]Warren JR,Marshall B.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis[J],Lancet，1983，321:1273-1275.

[2]Fujimura S,Kato S,Nagai K,etal.Detection of Helicobacter pylori in the stools of newborn infants [J].The Pedia Infecti Dis J,2004,23(11):1055-1056.

[3]查健忠,戴星,李冰冰.儿童幽门螺杆菌感染与胃黏膜病理变化的关系[J].临床儿科杂志,2010,28(1)：54-57.

[4]Del Giudice G,Covacci A,Telford JL,etal.The design of vaccines against Helicobacter pylori and their development[J].Annu Rev Immunol,2001，19:523-563.

[5]Summerton NA,Welch RW,Bondoc L,etal.Toward the development of a stable,freeze-dried formulation of Helicobacter pylori killed whole cell vaccine adjuvanted with a novel mutant of Escherichia coli heat-labile toxin[J].Vaccine,2010，28(5):1404-1411.

[6]杨钰欣,江吉富.新生BALB/c小鼠口服灭活幽门螺杆菌对特异性抗体的影响作用[J].医学美学美容,2015，(1):88-89.

[7]黄文,潘雪,李兆申.重组幽门螺杆菌过氧化氢酶脂质体疫苗免疫预防研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2005,14(4):359-365.

[8]闫东梅，朱迅.治疗性疫苗的发展现状与应用前景[J].中国生物制品学杂志，2005，18(6):535-537.

[9]Zeng M,Mao XH,Li JX,etal.Efficacy,safety,and immunogenicity of an oral recombinant Helicobacter pylori vaccine in children in China:a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase 3 trial[J].Lancet,2015，386(10002)：1457-1464.

[10]Nedrud JG,Bagheri N,Schn K,etal.Subcomponent vaccine based on CTA1-DD adjuvant with incorporated UreB class II peptides stimulates protective Helicobacter pylori immunity[J].PLoS One,2013，8(12):e83321.

[11]O′Ryan ML,Lucero Y,Rabello M,etal.Persistent and Transient Helicobacter pylori Infections in Early Childhood[J].Clin Infect Dis,2015，61(2):211-218.

[收稿2015-05-15修回2015-08-26]

(编辑许四平)

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Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori

YANGYu-Xin,JIANGJi-Fu.WomenandChildren′sHospitalofZunyi,Zunyi563000，China

[Abstract]Objective:To explore the Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori .Methods: Thirty-two BALB/c mice were randomly divided into four groups,including PBS control group(groupⅠ),the group of inactivated H.pylori(groupⅡ),the group of inactivated H.pylori and Escherichia cole heat-labile enterotoxin B subunit(LTB)(group Ⅲ),and normal group(group Ⅳ).Newborn BLAB/c mice within 24 hours were immunized through oral gavage with corresponding antigen,Two weeks after final immunization,the mice were challenged with 1×108CFU live H.pylori strain SS1,twice once day,for 2 days.The twenty-eighth day post-challenge,all of mice were sacrificed and stomachs were removed for grades of inflammation and The counting of H.pylori colonizing.Results: The mean scores of stomach tissue inflammation of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ were 2.25±0.46，2.12±0.35，1.5±0.53，0.25±0.46,respectively,and the score of inflammatory activity of the above four groups were 2.12±0.35，2.12±0.35，1.37±0.52，0.25±0.46.Among these four groups,the results were statistically significant between any two groups except the result between groupⅠand group Ⅱ.Finally,H.pylori colonization quantity in the stomachs of group Ⅲ was lower than groupⅠand group Ⅱ(P< 0.05),as expected,the H.pylori colonization was undetectable in group Ⅳ.Conclusion: The oral gavage with inactived H.pylori plus LTB to newborn mice may be associate with the lightening of inflammation and the decrease of H.pylori colonizing number.

[Key words]Inactivated H.pylori;LTB;Newborn BALB/c mice;Immunoprotection

通讯作者及指导教师：江吉富(1956年-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事感染与免疫研究，就职于遵义医学院，E-mail: jifujiang@163.com。

作者简介：杨钰欣(1983年-)，女，硕士，主要从事感染与免疫研究，就职于遵义医学院，E-mail: yangxx_123@126.com。

中图分类号R392.9

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0201-04