葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的设计及空间结构研究

王思雄　马惠文　王东林

(重庆市肿瘤研究所,重庆400030)

葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的设计及空间结构研究

王思雄马惠文王东林①

(重庆市肿瘤研究所,重庆400030)

[摘要]目的：以SEs氨基酸高度保守序列作靶序列设计抑制性多肽，研究筛选出的多肽P72的空间结构。方法：用生物信息学软件“Vector NTI 10.3，InsightII 2000,Discovery Studio 1.7”等分析及预测多肽P72的空间结构。结果：P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空间结构具有高度的相似性，P72远离SEB的TCR和MHCⅡ结合位。结论：P72可能不是与MHCⅡ类分子及TCR结合而产生的抑制作用，其具体的抑制机制有待深入研究。

[关键词]葡萄球菌肠毒素;超抗原;合成多肽

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin SEs)属于超抗原(SAg)，SEs进入体内，使得T淋巴细胞被大量激活，诱发机体强烈免疫反应，导致机体免疫系统紊乱。对于该毒素的治疗，常常应用被动免疫疗法的抗毒素血清，如国外有学者利用小鼠模型，构建包含葡萄球菌肠毒素A(SEA)和毒性休克综合征毒素(TSST-1)的融合蛋白产生的抗体，结果显示该抗体对SEs的致休克效应具有保护作用[1]。但是抗毒素血清无法应用于预防，另外其本身能激发人体的免疫反应而产生毒性。因此，针对SEs超抗原的致病机制，探讨新的主动免疫治疗手段，才可起到防治的目的。本研究通过对SEs氨基酸序列对比分析，设计并筛选对SEs具有广谱抑制活性的多肽，并通过对该多肽空间结构研究，探讨其广谱抑制功能的机制，为SEs相关疾病的防治提供新的手段。

1材料与方法

1.1抑制性多肽的设计根据已经报道的SEs家族的氨基酸序列排列，对SEs的下列特征进行研究。

SEs超抗原的氨基酸序列进行对比分析，找出氨基酸序列的同源部分序列[2]。用Vector NTI 10.3软件对SEs家族氨基酸序列进行同源性比较，并用Gene Doc软件显示和编辑比较结果。以SEB氨基酸序列作为肽设计的靶序列，并用Discovery Studio 1.7软件对SEB和SEC超抗原与MHC 结合位点进行显示和分析。

1.2多肽的合成采用Fmoc固相合成多肽(上海生工生物工程有限公司)，色谱测定纯度均为95%以上。

1.3蛋白质序列检索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的Swiss-Prot蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/sprot/index.htm)。蛋白质三维结构包括SEA(PDB accession code:1SXT)、SEB(PDB accession code:3SEB)、SEC2 (PDB accession code:1STE)、SEB-HLA DR1(PDB accession code:1SEB)。

1.4分子模型的显示、计算和结构预测以PDB数据库中的SEB 晶体结构的对应区域为模板，模拟了肽的三维结构。结构预测采用的是Sali等开发的一种基于“空间制约条件”的方法，计算工作均使用BIOSYM/MSI分子模拟系统，使用的软件是InsightII 2000 及Discovery Studio v1.7。

2结果

2.1SEs超抗原与MHC 结合的空间结构对比分析对SEB和SEC超抗原的空间结构进行对比分析，结果显示SEB和SEC的42~46位、92~98位氨基酸均与MHC直接接触，而且呈线性，位于非结构区域(图1A,B)，因此，根据这些氨基酸序列可以设计抑制性多肽。

2.2SEs氨基酸序列同源性及其MHC、TCR结合位对比分析SEA、SEB、SEC3、SED和SEE的同源性在33%~81%之间，具有多个高度同源性保守区域(同源性超过80%)，已经报道的SEs的某些MHC和TCR结合位于高度保守区。

2.3抑制性多肽的设计通过SEs氨基酸序列同源性及空间结构的比较，根据SEs氨基酸序列保守区域及及其MHC和TCR的结合位，设计了9条多肽，这些多肽均位于氨基酸序列保守区，其中P40、P113包含MHC结合位，P11、P19、P91包含TCR结合位。经过筛选，9条多肽中，P72能显著抑制SEs的促人PBMC增殖活性，其余多肽抑制作用不明显[3]。

2.4多肽P72的空间结构多肽P72在SEA、SEB和SEC2中的同源序列见图2，从P72在SEA、SEB和SEC2中的同源序列结构图中可以看出，P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空间结构具有高度的相似性。

2.5多肽P72在TCRVβ-SEB-MHCⅡ空间结构中的位置结果显示，在TCRVβ-SEB-MHCⅡ三分子相互作用的空间结构中，P72远离SEB的TCR和MHCⅡ结合位(图3)，图4示P72在SEB空间结构中的位置。

3讨论

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)是一类由金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)产生的蛋白质，均为超抗原分子，其引起的疾病谱非常广泛，毒性休克综合征、多器官功能障碍综合征、食物中毒、Kawasaki综合征、多发性脉管炎、哮喘等多种疾病与SEs超抗原有

关[4-9]。因此针对SEs设计广谱抑制性多肽，有望成为SEs相关疾病免疫防治的新手段。在前期的研究中，我们从SEs保守的同源氨基酸序列筛选出了一条广谱抑制性多肽P72，能显著抑制SEA、SEB、SEC三种超抗原促人PBMC增殖活性[3,10]。多肽P72能够显著抑制SEA、SEB和SEC的促PBMC增殖活性，显示了其广谱的抑制作用。多肽P72的氨基酸序列DLADKYKDKYVDVFG来源于超抗原SEB 的72~86位氨基酸残基序列，这些序列位于SE家族中的同源保守部分，序列对比分析显示SEA、SEB、SEC1和SEC2的72~86位氨基酸残基序列同源性较高，与SEA的同位置的氨基酸序列相比，在15个氨基酸残基中有9个相同，对于SEC1和SEC2则分别有10个和11个相同。空间结构比对可以看出，SEA、SEB和SEC2所对应的72~86位氨基酸序列的在空间结构非常相似。国外的研究也表明SEB的76~86位氨基酸序列在SE家族中不仅显示了序列的同源性，同时也显示了空间的保守性[11]。因此P72能够拮抗3种超抗原，显示其广谱抑制性。在前期研究的细胞模型结果显示，P72能明显抑制SEA、SEB、SEC刺激PBMC分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β，随多肽的剂量增加而抑制作用增强，并可能为竞争抑制作用[3]，竞争结合实验结果显示P72对SEs的抑制作用可能不是与MHC Ⅱ类分子结合产生的。这与国外研究结果相反[12]，这可能是纯化、修饰应用于合成P72过程中，其空间结构和性质可能发生了变化[10]。

国外研究者Jett等[13]认为其设计的多肽与SEs的氨基酸序列中参与调节T细胞增殖的某些保守区域结合而发挥抑制作用。Arad[12,14]没有做相关的实验，因此不清楚其设计的多肽P12是与MHC Ⅱ类分子还是TCRVβ链结合。Visvanathan等[15]研究了多肽6343的结合位点，利用人HLA-DR-1的ELISA结合试验研究了该肽分子与MHC Ⅱ类分子的结合活性，结果显示多肽6343与MHC Ⅱ类分子具有很高的亲和活性，表明此肽与SE竞争结合PBMC的MHC Ⅱ类分子的结合位点而发挥广谱抑制作用。

超抗原能够绕过主要组织相容性复合体的限制以及细胞内抗原加工和提呈，直接与MHCⅡ类分子和TCR分子结合[16]。国外研究利用SEB与MHCⅡ类分子和TCR分子相互作用的三分子空间模型，研究设计的抑制性多肽的抑制活性功能，已经有研究显示了SEs家族的TCR的结合位点，如SEB的氨基酸序列81~93可能是TCR分子的结合位点[12,16,17]。P72的氨基酸序列来源于超抗原SEB的72~86位氨基酸序列，其中81~86位残基部分地涉及801~93序列，有可能与TCR分子结合，但在TCRVβ-SEB-MHCⅡ三分子相互作用的空间结构图中，我们看到，P72远离SEB的TCR和MHCⅡ结合位，这表明SEB上的P72这段氨基酸序列可能既不与MHC也不与TCR结合，由于研究条件限制，P72与TCR结合的实验未能进行，因此P72是否与TCR结合无法确定。

除了与MHC 和 TCR 结合产生抑制作用外，抑制性多肽还可能通过与 T 细胞或APC 上的受体结合诱导多肽适应并模拟SEs超抗原分子上的对应区域产生竞争抑制作用。如通过影响超抗原功能的协同刺激分子 (如 CD28/B7 和细胞毒性 T 细胞抗原 4/B7 等)之间的相互作用而发挥抑制作用，P72 的抑制效应是否为上述抑制途经，有必要在将来的研究中探讨[10,12,14]。 综上，本研究运用同源建模的方法，对P72的SEs广谱抑制机制进行了研究，发现多肽P72不与MHC结合，可能也不与TCR结合，其具体的抑制机制有必要在今后的研究中进行探索，本研究可为SEs相关疾病的免疫防治提供线索和手段。

参考文献：

[1]Reddy PN,Paul S,Sripathy MH,etal.Evaluation of recombinant SEA-TSST fusion toxoid for protection against superantigen induced toxicity in mouse model[J]. Toxicon,2015，103:106-113.

[2]Kotzin BL,Leung DY,Kappler J,etal. Superantigens and their potential role in human disease[J]. Adv Immunol 1993,54:99-166.

[3]王思雄,李亚斐,熊鸿燕,等.合成多肽P72对葡萄球菌肠毒素超抗原抑制效应的研究[J].免疫学杂志,2008,28(1):12-15.

[4]Cui XY,Miao JL,Lu HQ,etal.Serum levels of specific IgE to Staphylococcus aureus enterotoxins in patients with chronic rhinosinusitis[J].Exp Ther Med,2015,9(4):1523-1527.

[5]Homey B,Meller S,Savinko T,etal. Modulation of chemokines by staphylococcal superantigen in atopic dermatitis[J].Chem-Immunol-Allergy,2007,93:181-194.

[6]Stroud M H OC,Jaquiss R EA.Successful use of extracorporeal membrane oxygenation in severe necrotizing pneumonia caused by Staphylococcus aureus[J].Pediatr Crit Care Med,2007,8(3):282-287.

[7]Niebuhr M,Mainardy J,Heratizadeh A,etal.Staphylococcal exotoxins induce interleukin 22 in human th22 cells[J].Int Arch Allergy Immunol,2014,165(1):35-39.

[8]Bachert C,Zhang N,Patou J,etal.Role of staphylococcal superantigens in upper airway disease[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol,2008,8(1):34-38.

[9]Sintobin I,Keil T,Lau S，etal. Is immunoglobulin E to staphylococcus aureus enterotoxins associated with asthma at 20 years? [J].Pediatr Allergy Immunol,2015.doi:10.111 1/pai.12396

[10]王思雄,李亚斐,马惠文,等.葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的功能研究[J].免疫学杂志,2012,28(5):403-407.

[11]Hoffmann ML,Jablonski LM，Crum KK，etal. Predictions of T-cell receptor and major histocompatibility complex-binding sites on staphylococcal enterotoxin C1[J]. Infect Immun.1994,62,3396-3407.

[12]Arad G,Levy R,Hillman D,etal.Superantigen antagonist protects against lethal shock and defines a new domain for T-cell activation[J].Nat Med,2000,6(4):414-421.

[13]Jett M,Neill R,Welch C,etal.Identification of staphylococcal enterotoxin B sequences important for induction of lymphocyte proliferation by using synthetic peptide fragments of the toxin[J].Infect Immun,1994,62(8):3408-3415.

[14]Arad G,Hillman D,Levy R,etal.Broad-spectrum immunity against superantigens is elicited in mice protected from lethal shock by a superantigen antagonist peptide[J].Immunol Lett,2004,91(2/3):141-145.

[15]Visvanathan K,Charles A,Bannan J,etal.Inhibition of bacterial superantigens by peptides and antibodies[J].Infect Immun,2001,69(2):875-884.

[16]Llewelyn M,Cohen J.Superantigen antagonist peptides[J].Crit Care,2001,5(2):53-55.

[17]Kaempfer R.Peptide antagonists of superantigen toxins[J].Mol Divers,2004,8(2):113-120.

[收稿2015-07-25修回2015-08-21]

(编辑许四平)----------------------------------------------

Study on design and three-dimension structure of a broad-spectrum inhibitory peptide against staphylococcal enterotoxins superantigen

WANGSi-Xiong，MAHui-Wen，WANGDong-Lin.ChongqingTumorInstitute,Chongqing400030,China

[Abstract]Objective:Peptides were designed on the basis of high conservative regions of amino acid sequences and structures of the SEs,three-dimension structure of P72 was constructed.Methods: Bioinformatics analysis softwares such as Vector NTI 10.3，InsightII 2000,Discovery Studio 1.7 were used to analyse and predict the space structure of P72.Results: three-dimensional domains of the peptide P72 from SEA,SEB and SEC were quite similar,Peptide P72 was far away from TCRVβ chain and MHC class II molecule.Conclusion: The inhibitory activity of peptide P72 may not due to binding to MHCⅡ and TCRVβ chain.The exact mechanism of inhibitory activity of P72 should be explored.

[Key words]Staphylococcal enterotoxin;Superantigen;Synthetic peptide

作者简介：王思雄(1973年-)，男，博士，主治医师，主要从事肿瘤免疫、分子免疫学方面的研究，E-mail:154055617@qq.com。

通讯作者①，E-mail:donglinw@21cn.com。

中图分类号R392.11

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0197-04