黄芪多糖对甲流HA2蛋白真核表达载体免疫效果影响的研究①

褚兆苹　吴淑慧　刘文泰　马志红　徐丙元　罗　俊　曹　刚　徐华洲　石玉娥　戴　军

(河北省人民医院妇产科，石家庄050051)

黄芪多糖对甲流HA2蛋白真核表达载体免疫效果影响的研究①

褚兆苹吴淑慧②刘文泰②马志红②徐丙元②罗俊③曹刚②徐华洲②石玉娥②戴军②

(河北省人民医院妇产科，石家庄050051)

①本文受河北中医学院博士科研基金(BSZ2014002)和河北省卫生厅课题(20130139)资助。

②河北中医学院基础医学院，石家庄050200。

③四川大学基础医学与法医学院微生物教研室，成都610041。

[摘要]目的：检验不同剂量黄芪多糖对甲流HA2蛋白真核表达质粒免疫大鼠效果的影响。方法：首先，将编码HA2的质粒pHA2/EGFP转染CHO细胞，通过PT-PCR和荧光检验其在真核细胞中的表达效果。然后将60只大鼠随机分为6组，分别注射pEGFP-N1、生理盐水和pHA2/EGFP加不同浓度的黄芪多糖，注射前收集大鼠血清作为对照，据最后一次注射后第36天处死各组大鼠收集各组大鼠的血清，测量血清中细胞因子IFN-γ、IL-4和血清中IgG对不同流感毒株血凝素的反应情况。结果：pHA2/EGFP+中等剂量APS组的IFN-γ、IL-4和血清中IgG对血凝素的反应情况均与低剂量组和阴性对照组有显著性差异(P<0.05)。pHA2/EGFP+中等剂量APS组的细胞因子水平和对血凝素反应与高剂量组无显著性差别(P>0.05)。结论：中等剂量的黄芪多糖能增强甲流HA2蛋白真核表达质粒的免疫效果。

[关键词]流感病毒；血凝素；IFN-γ；IL-4

甲型流感病毒是由八个RNA片段和其编码的蛋白组成的正黏液病毒，该病毒导致了很多次流感世界性大流行[1,2]，每次世界性大流行均给世界造成了很大损失，所以预防甲型流感病毒的感染非常重要。组成流感病毒的蛋白中与预防关系最为密切的是血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)，针对HA的抗体可以阻止流感病毒侵入细胞，从而起到很好的预防作用。但HA变异非常厉害，这导致流感病毒能够逃脱人体免疫的监视，这也是甲流病毒反复流行的重要原因。

如何更有效地预防甲型流感病毒？我们通过下载National Center for Biotechnology Information (NCBI)上不同流感病毒HA序列并进行序列比对后发现甲型流感病毒HA的序列中自N段开始从350号氨基酸到C段的氨基酸序列在不同流感病毒株之间序列比较保守，该序列位于流感病毒HA的尾端(HA2)，所以如果我们能够诱导出针对HA2的有效免疫，那么我们就能更有效地控制不同流感病毒株的感染。但HA2在自然界中免疫原性比较差[3,4]，所以提高HA2的免疫原性就非常重要。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides increase，APS)具有调节免疫作用[5]，一定剂量的黄芪多糖对免疫细胞有刺激作用，那么APS是否能够能提高表达HA2的真核表达载体的免疫原性？针对这个问题，我们设计了以下实验。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料pEGFP-N1购自美国的Clontech公司，HA2序列(A/PR/8/34的HA部分序列，自羟基端开始从1050号核苷酸到1730号核苷酸序列)由英韦创津公司合成。实验前我教研室已经将HA2序列插入pEGFP-N1中，酶切位点为EcoRⅠ和BamHⅠ，此质粒命名为pHA2/EGFP。CHO细胞系购自美国ATCC。Escherichia coli DH5a感受态细胞购于全式金生物技术有限公司。雄性Wistar 大鼠60只，12 周龄，体重(200±20)g，购自河北医科大学实验动物中心[合格证号SCXK(冀)2014-1-003]，清洁级。

1.1.2仪器微量台式高速冷冻离心机(Thermo 公司)；微量可调加样器(Eppendorf)；电热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-18C)；基因扩增仪(Thermo 公司，TCP0096)；电泳仪(北京六一仪器厂，DYCZ-20C)；酶标仪(北京六一仪器厂，WD-2103A)；凝胶成像系统(美国伯乐公司，GelDoc XR+)等。

1.1.3药物与试剂黄芪多糖购自西安沃森生物科技有限公司；不同株流感病毒纯HA蛋白H5和H1均购自BD公司；RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物公司；HRP标记的羊抗大鼠IgG抗体购自北京华夏远洋科技有限公司；组织裂解液购自武汉博士德公司；IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司；Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染CHO细胞用含有10%FBS、1%青链霉素的1640培养基，在5%CO2、37℃条件下在六孔板中培养。培养至细胞汇合约60%时，按Lipofectamine 2000试剂盒说明书将质粒pHA2/EGFP和pEGFP-N1转染CHO细胞，以生理盐水(NS)作为空白对照。转染48 h后，观察EGFP绿色荧光表达情况。

1.2.2HA2基因表达的检测收集各组转染细胞，按照RT-PCR试剂盒要求提取总RNA后，做RT-PCR。HA2的上游引物为CCGCTCGAGTATTGAAGGGGGATGGA，下游引物为CGCGGATCCTCATATTTCTGAAATTCTAAT，长度为700 bp。RT-PCR条件参照试剂盒要求条件进行。RT条件如下：采用20 μl体系，第一链cDNA合成温度为42℃，30 min；PCR条件为95℃，5 min。95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，60 s，共进行25个循环。PCR结束后，进行电泳。电泳条件为含溴化乙锭的1%的琼脂糖凝胶上样后，100 V，45 min，电泳结束后，在凝胶成像系统紫外灯下照相。

1.2.3动物分组Wistar大鼠60只，随机分为六组，每组10只。六组分别是pEGFP-N1组、pHA2/EGFP+高剂量APS组(pHA2/EGFP+high dose of APS，pHA2/EGFP+hAPS)、pHA2/EGFP+中剂量APS组(pHA2/EGFP+medium dose of APS，pHA2/EGFP+mAPS)、pHA2/EGFP+低剂量APS组(pHA2/EGFP+low dose of APS，pHA2/EGFP+lAPS)、pHA2/EGFP组和生理盐水组(Normal saline，NS)。pEGFP-N1组给予大鼠双侧后腿股四头肌肌内注射pEGFP-N1空质粒共100 μg，每侧各50 μg，共注射两次，间隔3周；pHA2/EGFP+hAPS组给予pHA2/EGFP共100 μg，每侧各50 μg，共注射两次，间隔3周，同时腹腔注射黄芪多糖0.9 g/(kg·d)，连续腹腔注射3周；pHA2/EGFP+mAPS组在注射pHA2/EGFP同时腹腔注射黄芪多糖0.5 g/(kg·d)，连续腹腔注射3周；pHA2/EGFP+lAPS在注射pHA2/EGFP同时腹腔注射黄芪多糖0.1 g/(kg·d)，连续腹腔注射3周；pHA2/EGFP组给予pHA2/EGFP共100 μg，每侧各50 μg，共注射两次，间隔3周；生理盐水组给予生理盐水每侧各50 μl，共注射两次，间隔3周。

1.2.4标本收集以上各组给药前收集大鼠尾静脉血液，分离血清，标记为免疫前血清，置-70℃备用。最后一次给药结束36 d处死各组大鼠，收集各组大鼠的血液，分离血清，标记为免疫后血清置-70℃备用。

1.2.5血清细胞因子测定按照博士德公司的IFN-γ和IL-4 ELISA试剂盒说明书测定保存血清的IFN-γ和IL-4水平。

1.2.6抗体水平测定将H1和H5用PBS稀释至200 ng/ml，再向空白ELISA板每孔中加入100 μl H1或H5，4℃包被过夜，封闭液洗涤待用。将各组血清分别加入包被好的各个孔中，每个孔加入100 μl血清，4℃过夜，洗涤，然后每孔中在加入100 μl稀释后的HRP标记的羊抗大鼠IgG抗体(1∶5 000稀释)，洗涤后加入底物显色10 min，终止反应后测定490 nm的OD值。实验重复3次，每个标本取平均值作为结果。

2结果

2.1重组质粒pHA2/EGFP的细胞转染和鉴定重组质粒pHA2/EGFP按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书转染CHO细胞，转染48 h后观察GFP的绿色荧光表达情况。如图1所示pHA2/EGFP和pEGFP-N1组均有荧光出现。如图1、2所示，收集各组细胞进行RT-PCR后只有pHA2/EGFP组出现700 bp左右的条带。

2.2各组大鼠血清细胞因子水平各组大鼠血清细胞因子变化如表1所示，pHA2/EGFP+mAPS组血清IL-4水平和IFN-γ水平与pHA2/EGFP+lAPS组有显著性差异(P<0.05)。pHA2/EGFP+mAPS组血清IL-4水平和IFN-γ水平与pEGFP-N1组有差异(P<0.05)。pHA2/EGFP+mAPS组血清IL-4水平和IFN-γ水平与pHA2/EGFP+hAPS组无显著性差异(P>0.05),pEGFP-N1组与生理盐水组无显著性差异(P>0.05)，pHA2/EGFP组与pHA2/EGFP+lAPS组无显著性差异(P>0.05)。

2.3各组大鼠血清IgG水平如表2和表3所示，免疫前各组血清无显著性差别。免疫后pHA2/EGFP组、pHA2/EGFP+lAPS组、pHA2/EGFP+mAPS组和pHA2/EGFP+hAPS组血清IgG水平与免疫前上述组血清有显著性差异(P<0.05)。当使用H1包被ELISA板时，pHA2/EGFP+mAPS组测得反映血清IgG量的OD值与pHA2/EGFP+lAPS组和pEGFP-N1组均有显著性差异(P<0.05)。pHA2/EGFP组与pHA2/EGFP+lAPS组无显著性差异(P>0.05)。当使用H5包被ELISA板时，我们也得到了相似结果，区别只是使用H5包被ELISA板时，测得的OD值低于使用H1包被ELISA板得到的OD值。免疫前各血清OD值无显著性差别(P>0.05)。当使用H1或H5包被ELISA板时，pHA2/EGFP+mAPS组测得反映血清IgG量的OD值与pHA2/EGFP+hPS无显著性差别(P>0.05)。pHA2/EGFP组与pHA2/EGFP+lAPS组无显著性差异(P>0.05)。

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS,1)P<0.05;vs pHA2/EGFP，2)P<0.05；vs pHA2/EGFP+hAPS，3)P>0.05.

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS，1)P<0.05；vs pEGFP-N1，2)P<0.05.

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS，1)P<0.05；vs pEGFP-N1，2)P<0.05.

3讨论

甲型流感病毒属于正黏病毒科RNA病毒，其核酸由八个片段组成。甲型流感病毒以感染肺部为主，具有明显的嗜肺性[6]。该毒曾经数次引起世界性大流行，给世界造成很大损失，以预防甲流病毒非常重要。在预防甲流病毒方面，位于甲流病毒表面的HA非常重要[7,8]。HA包括两个部分，分别是位于头端的HA1和位于尾端的HA2。有报道认为，抗HA的抗体能很好阻止甲流病毒进入靶细胞。所以如果能诱导机体产生大量抗HA的抗体，就可以很好预防甲流病毒。但甲流HA包括H1、H5等数个血清型且变异频率非常高，这给甲流病毒的预防带来了很大困难。

我们通过对不同毒株的甲流病毒HA分析发现，甲流病毒HA的尾端(HA2)非常保守[3,4]，如果能够诱导出针对HA2的抗体我们就可以很好地预防甲流病毒，但HA2 免疫原性比较差，如何增强HA2的免疫原性就显得非常重要。而很多文章报道，中药黄芪的主要成分黄芪多糖能够调节免疫，那么黄芪多糖是否可以用于增强HA2的免疫原性？我们的实验结果证实一定剂量[0.5 g/(kg·d)]黄芪多糖与表达HA2的真核表达载体联用确实能够诱导机体产生更多的IFN-γ和IL-4，但当剂量过低时并不能诱导机体产生IFN-γ和IL-4，甚至当抑制免疫的一些药物与黄芪多糖同时使用时，黄芪多糖可能还会在一定程度上抑制免疫，以前我们的实验结果也说明了这一点[9]，这个现象的机理还需要进一步研究。IFN-γ与细胞免疫关系密切，在机体中可以起到抗病毒作用[10]。而黄芪多糖诱导机体产生更多IFN-γ就意味着黄芪多糖能够增强机体的细胞免疫。IL-4与体液免疫关系密切[11]，黄芪多糖诱导机体产生更多IL-4，就意味着黄芪多糖能够增强机体的体液免疫。而血清IgG的结果也证实当使用中等剂量黄芪多糖时，机体产生的抗体确实增加了，这也从一个侧面说明体液免疫得到了有效加强。我们的实验结果还说明超过中等剂量的黄芪多糖并不能无限增强免疫，这提示我们今后使用黄芪多糖时，剂量不是越大越好的。

HA2上存在很多保守的表位[3,4]。我们的实验结果也证实使用A/PR/8/34(H1N1)的HA2免疫大鼠可以使大鼠产生抗体能同时对抗H1和H5。以前，我们使用小鼠也得出相同的结果[3,4]，这说明使用表达HA2的质粒免疫不同动物确实可以诱导机体产生能结合多种HA的抗体，这些研究为马上进行的临床试验打下了基础。有意思的是抗体与H5结合的能力略小于与H1的结合能力，这说明H5的HA2部分与H1有部分差别。尽管这样，抗体与H5结合力仍远大于阴性对照。这说明使用H1的HA2部分诱导出的抗体也能结合H5。在血凝素为H5的毒株中有相当多的是禽流感，有部分甚至是高致病性的禽流感，这些禽流感致死率高，而且因为对禽类也有很高致死率，所以使用国际通用的鸡胚来生产疫苗的方法，如果用来生产抗高致病性禽流感的疫苗将非常困难，而且禽流感在我们也时常发生，而本实验结果也为生产这种抗高致病性禽流感的疫苗找到了一种方法。

参考文献：

[1]Mair CM,Meyer T,Schneider K,etal.A histidine residue of the influenza virus hemagglutinin controls the pH dependence of the conformational change mediating membrane fusion[J].J Virol,2014,88(22):13189-13200.

[2]O′donnell CD,Vogel L,Matsuoka Y,etal.The matrix gene segment destabilizes the acid and thermal stability of the hemagglutinin of pandemic live attenuated influenza virus vaccines[J].J Virol,2014,88(21):12374-12384.

[3]Dai J,Pei D,Wang B,etal.Molecular adjuvant Ag85A enhances protection against influenza A virus in mice following DNA vaccination[J].Viruses,2012,4(12):3606-3624.

[4]Dai J,Pei D,Wang B，etal.A novel DNA vaccine expressing the Ag85A-HA2 fusion protein provides protection against influenza A virus and Staphylococcus aureus [J]. Virol J，2013,10:40.

[5]黄家林,张勇.黄芪多糖抗炎免疫作用机制研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013,11(11):1374-1376.

[6]Spronken MI,Short KR,Herfst S,etal.Optimisations and challenges involved in the creation of various bioluminescent and fluorescent influenza a virus strains for in vitro and in vivo applications[J].PLoS One,2015,10(8):e0133888.

[7]Wu Y,Cho M,Shore D，etal.A potent broad-spectrum protective human monoclonal antibody crosslinking two haemagglutinin monomers of influenza A virus [J]. Nat Commun，2015，6:7708.

[8]Liu Q,Xue C,Zheng J,etal.Influenza bivalent vaccine comprising recombinant H3 hemagglutinin (HA) and H1 HA containing replaced H3 hemagglutinin transmembrane domain exhibited improved heterosubtypic protection immunity in mice[J].Vaccine,2015,33(32):4035-4040.

[9]褚兆苹,吴淑慧,刘文泰,等.大剂量黄芪多糖增强甲型流感病毒NS蛋白表达的研究[J].中国免疫学杂志,2015,31(5):629-631,637.

[10]Shao L,Cong Z,Li X,etal.Changes in levels of IL-9,IL-17,IFN-γ,dendritic cell numbers and TLR expression in peripheral blood in asthmatic children with Mycoplasma pneumoniae infection[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):5263-5272.

[11]Kumari A,Dash D,Singh R.Lipopolysaccharide (LPS) exposure differently affects allergic asthma exacerbations and its amelioration by intranasal curcumin in mice[J].Cytokine,2015,76 (2):334-342.

[收稿2015-08-15修回2015-09-15]

(编辑张晓舟)

Research of astragalus polysaccharides increasing immune effect of influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector

CHUZhao-Ping,WUShu-Hui,LIUWen-Tai,MAZhi-Hong,XUBing-Yuan,LUOJun,CAOGang,XUHua-Zhou,SHIYu-E,DAIJun.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,GeneralHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050051，China

[Abstract]Objective:To study the astragalus polysaccharides (APS) effect on immune induced by influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector.Methods: The HA2 encoded by the DNA vaccine vector was efficiently expressed in CHO cells,as determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and fluorescence analysis.60 rats were divided into six groups randomly,which were immunized with normal saline,pEGFP-N1,pHA2/EGFP+different dose of APS by intramuscular injection.The control sera were collected before injection.After injected the 36th day,sera were collected to analyzing IFN-γ,IL-4 and IgG level.Results: IFN-γ,IL-4 and IgG level of pHA2/EGFP+mAPS group was different from that of pEGFP-N1 group or pHA2/EGFP +lAPS group(P<0.05).Conclusion: Middle dose of APS could increase immune induced by influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector.

[Key words]Influenza A virus;Hemagglutinin;IFN-γ;IL-4

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.010

通讯作者及指导教师：戴军(1976年-)，男，博士，讲师，主要从事核酸疫苗研究工作，E-mail:calldj@163.com。

作者简介：褚兆苹(1978年-)，女，硕士，主治医师，主要从事妇科感染性疾病研究，E-mail：2582079419@qq.com。

中图分类号R373.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0189-05