阿司匹林对SD大鼠小肠黏膜生长抑素受体水平的影响①

杨天飞　郑　桐　谭庆华　车筑平

(贵阳医学院附属医院，贵阳550004)

阿司匹林对SD大鼠小肠黏膜生长抑素受体水平的影响①

杨天飞郑桐②谭庆华③车筑平

(贵阳医学院附属医院，贵阳550004)

①本文为贵州省科技厅基金(E2011-10)。

②广东省潮州市潮州医院，潮州521001。

③四川大学华西医院，成都610000。

[摘要]目的：通过观察非甾体消炎药(Non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)阿司匹林不同给药途径对大鼠小肠黏膜屏障及生长素抑素受体(Somatostatin receptors SSTR)水平的影响，探讨阿司匹林的最佳给药途径。方法：32只SD大鼠随机分为灌胃组、灌肠组、腹腔注射组及空白对照组四组，每组8只。对回肠黏膜损伤进行评分；ELISA检测各组回肠组织SSTR水平;免疫组化检测各组回肠组织SSTR的分布,图像分析软件测定IOD值。结果：(1)阿司匹林治疗组回肠黏膜损伤指数比正常对照组高(P<0.05)，但各实验组之间两两比较黏膜损伤评分无差别；(2)各亚型SSTR在大鼠小肠黏膜均有表达，以SSRT1及SSTR2为主(P<0.05)；(3)与空白对照组比较,实验组大鼠小肠黏膜中SSTR1-5表达均降低(P<0.05)；(4)不同的给药方式对SSTR1-5的影响不完全一致，部分P<0.05。(5)四组间SST浓度、IOD值差异无统计学意义。结论：阿司匹林可以导致大鼠小肠黏膜的损伤。各亚型SSTR在大鼠小肠黏膜均有表达，阿司匹林可以导致小肠黏膜各型SSTR的表达下降，提示这种变化可能影响小肠黏膜的屏障功能。不同的给药途径对SSTR的影响不尽相同，提示我们使用阿司匹林时胃肠外给药可能会减少肠道损伤的发生。

[关键词]小肠黏膜；阿司匹林；生长抑素受体1-5；给药途径

非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一类不含有甾体结构的抗炎药，包括阿司匹林、双氯芬酸、对乙酰氨基酚、塞来昔布等。NSAIDs广泛运用于临床，具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，但其胃肠道副作用不容忽视。NSAIDs导致小肠黏膜屏障的损害机制尚不完全明确，可能和多种保护因素及损害因素有关，生长抑素(Somatostatin,SST)就是其中的一个重要保护因素。然而，SST发挥作用的关键是生长抑素受体(Somatostatin receptor，SSTR)在细胞膜上的表达。 本研究通过对大鼠的实验性研究，观察阿司匹林对大鼠小肠黏膜的损伤及对生长素抑制激素受体(SSTR)的影响，探讨提高保护肠黏膜屏障的办法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂注射用精氨酸阿司匹林，海南灵康制药有限公司生产。一抗试剂：兔抗鼠SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5单克隆抗体，二抗试剂：Sp免疫组化检测试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司生产。96孔ELISA试剂盒：SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5,上海丰翔生物有限公司生产。

1.1.2实验动物及分组32只12周龄Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半(重庆实验动物中心提供)，体质量(198.6±18.8)g。随机分为实验组(灌胃组、灌肠组、腹腔注射组)及空白对照组，每组8只。实验组分别给予精氨酸阿司匹林(100 mg/kg)灌胃、灌肠、腹腔注射(采用灌胃针进行灌胃及灌肠，无菌注射针进行腹腔注射)，空白对照组不予特殊处理，以相同条件喂养。于14 d处死实验动物后留取距回盲部5 cm回肠组织-80℃保存备用，进行有关指标的观察和测定。在进行本实验前，先做了预实验提示：阿司匹林50 mg/kg，7 d，进行大体观察、检测相关指标，没有发现大体标本有损伤，检测指标没有差异，故增加剂量及时间为100 mg/kg，14 d，进行检测；本实验主要是观察阿司匹林对小肠的影响，由于回肠末段淋巴滤泡相对丰富，病变多发部位，而且是临床上结肠镜检查易于到达的部位，故选取距离回盲部5 cm。

1.2方法

1.2.1小肠黏膜组织形态学观察采用Chiu氏6级评分法评价肠黏膜损伤程度(评分越高，损伤程度越重)[1]：0分：肠黏膜绒毛正常；1分：绒毛顶端上皮下出现囊状间隙，并伴有毛细血管充血；2分：上皮下间隙扩大，中度固有层水肿，中央乳糜管扩张；3分：固有层明显水肿，肠黏膜上皮层细胞变性、坏死，少数绒毛顶端脱落；4分：上皮细胞层变性坏死、脱落，部分绒毛脱落，固有层裸露，毛细血管扩张、充血；5分：绒毛脱落，固有层崩解，出血或溃疡形成。光镜下每个样本随机计数5个视野。

1.2.2生长抑素受体(SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5)免疫组织化学检测及图像分析采用免疫组织化学方法(SP法)，所有检测项目均以PBS作为相应的阴性对照。取回肠末段组织进行石蜡包埋-切片-脱蜡-修复抗原-一抗、二抗程序作用-加入酶标链酶卵白素复合物-DAB室温显色-苏木素复染-脱水-封片，显微镜观察。阳性显色为棕黄色。采用Image Pro plus图像分析软件进行半定量分析，每个样本随机检测5个高倍视野(×400)，计算阳性细胞IOD值，得出5个高倍视野的均数，即代表该样本阳性细胞IOD值。

1.2.3生长抑素受体(SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5)ELISA定量分析,每个样本均设复孔。取上述回肠组织100 mg，剪碎为3×3 mm大小，加1 ml PBS液，低温匀浆，放入1.5 ml离心管，以1 000 r/min,4℃，5 mim 离心，取上清液分装待用。

2结果

2.1小肠形态组织学变化本组研究中小肠黏膜大体标本观察可见黏膜散在充血点，未见明显的黏膜出血、溃疡等病变。光学显微镜下组织学变化：对照组大鼠小肠黏膜结构完整，偶可见绒毛上皮缺损和少量炎性细胞浸润。实验组大鼠可见肠绒毛肿胀、缩短、增粗，顶端部分破损或断裂，部分可见黏膜局灶糜烂、坏死，黏膜下间隙增大，固有层水肿明显伴炎症细胞浸润,出现上皮细胞变性、坏死、剥脱，部分绒毛融合、缩短，甚至固有层裸露(图1)。

灌胃组、灌肠组、腹腔注射组Chiu氏评分平均分别为2.13分、2.03分和1.82分，三组之间差异没有统计学意义。与空白对照组0分相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2SSTR表达变化

2.2.1空白对照组各型SSTR的表达情况通过ELISA定量分析及免疫组化观察SSTR的阳性表达，显示各亚型SSTR在大鼠小肠黏膜中均有不同的表达，以SSTR1表达最高(P<0.05)、其次为SSTR2(P<0.05)，SSTR3、SSTR4、SSTR5的表达均较低(与SSTR1、SSTR2比较P<0.05)见表2及图2。

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05.

2.2.2ELISA定量分析大鼠回肠SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5灌胃组、灌肠组SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5水平与正常对照组比较降低(P<0.05)，三组阿司匹林处理组之间两两比较其水平无差异；腹腔注射组SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5水平与正常对照组比较也降低，但SSTR1、SSTR2、SSTR3与空白对照组比较无差异(P>0.05)，分别与灌胃组、灌肠组比较有差异(P<0.05)；腹腔注射组SSTR4、SSTR5水平与正常对照组比较有差异，分别与灌胃组、灌肠组比较无差异。见表3。

Note：Compared with SSTR1,1)P<0.05，compare with SSTR2,2)P<0.05.

2.3免疫组化显示回肠黏膜SSTR分布情况(图2)及量变情况(表4)灌胃组、灌肠组各型SSTR的IOD值与正常对照组比较降低(P<0.05)，三组阿司匹林处理组之间两两比较其水平无差异；腹腔注射组各型SSTR的IOD值与正常对照组比较也降低，但SSTR1、SSTR2、SSTR3与空白对照组比较无差异(P>0.05)，分别与灌胃组、灌肠组比较有差异(P<0.05)；腹腔注射组SSTR4、SSTR5的IOD值与正常对照组比较有差异，分别与灌胃组、灌肠组比较无差异。

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05，compare with intraperitoneal injection group,2)P<0.05.

2.4SST表达变化ELISA定量分析SST水平及免疫组化观察SST的表达情况显示，灌胃组、灌肠组、腹腔注射组与正常对照组比较无差异(P>0.05)。三组阿司匹林处理组中，三组间两两比较其水平没有差异(P>0.05)，见表5及图3。

表5SST 在各组大鼠肠黏膜中表达情况

Tab.5Changes SST in local site of ileum mucosa in rat

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05，compared with intraperitoneal injection group,2)P<0.05.

Note：Compared with normal control group,1)P>0.05.

3讨论

NSDIAs相关性小肠损害主要有糜烂及溃疡、小肠慢性失血、蛋白丢失、回肠吸收功能障碍,肠穿孔、大出血、肠腔狭窄(有环形狭窄和隔状狭窄)导致的肠梗阻等[2-4]。本研究中，大鼠小肠黏膜肉眼大体观察损伤不明显，部分标本可见少许黏膜充血及黏膜下出血点，但在显微镜下可明确的看到小肠绒毛肿胀、缩短、增粗，顶端部分破损或断裂，黏膜局灶糜烂、坏死，黏膜下间隙增大等改变。根据Chiu氏评分结果实验组与空白对照组是有差异的，这说明NSAIDs的对大鼠小肠黏膜屏障的破坏是肯定的。本组资料大体损害不明显，与其他研究有差异[2-4]，在不同给药途径之间的黏膜损伤比较以灌胃组明显，但无统计学意义。分析原因可能与药物的种类、剂型及用药时间相关，尤其是用药时间的影响，根据文献报道，NSAIDs引起小肠病变，尤其是较严重的病变，如溃疡、小肠狭窄等大都见于是长期或大量服用NSAIDs患者[4,5]。

SSTR可以表达在全身大多数器官和组织，在大脑、胃肠道、垂体、内分泌和外分泌的胰腺、肾上腺、甲状腺、免疫细胞、视网膜细胞都有SSTR的存在[6,7]。SSTR是生长抑素(SST)发挥作用的重要介质。SST是肠道重要的神经内分泌递质,具有对包括机体免疫功能在内的广泛生理调节功能[8]。可以通过多种途径减轻肠道黏膜炎症、增强天然免疫和促进上皮修复的作用，广泛的运用于临床。内源性SST对肠黏膜浆细胞的发育具有重要的正性调控作用，外源性补充SST可有效改善内源性SST缺乏的状态,维护肠黏膜获得性体液免疫[9]。众多研究还表明，在很多人类肿瘤如类癌、嗜铬细胞癌、胃泌素瘤、胃癌、结直肠癌、肝癌等中均证明有SSTR的表达,这就为SST及其类似物应用于肿瘤的治疗提供了可能[10,11]。通过本实验数据也可以观察到，各型生长抑素受体在大鼠的小肠道黏膜均有不同程度的表达，其中以SSTR1及SSTR2为主。SSTR具有识别不同信使的能力，并能通过一些直接或间接的偶联系统启动生物学反应。从SSTR的生理作用上看，各型SSTR之间起到一个协同作用。在给予阿司匹林处理后，SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5的处理组的表达均低于空白对照组，灌胃组、灌肠组与空白对照组比较，差异有显著性。而同期的研究表明，相同状态下，内源性SST的分泌并没有明显变化[12]。说明阿司匹林导致SSTR1-5的表达降低，使得内源性的SST或外源性的SST不能充分的起到黏膜保护屏障的作用，导致小肠黏膜屏障的破坏，引起小肠黏膜糜烂及溃疡、慢性失血、蛋白丢失、功能障碍等临床表现。提示我们，可否通过人为的干预，使SSTR的表达增加，促进SST的生理作用，使肠黏膜屏障得以修复、炎症反应得以减少呢？由于各型SSTR之间的作用有协同性，并且天然的 SST 与 5 种亚型受体结合几乎无选择性而结合力都较强，是否只需要促使其中的一种或两种亚型受体表达增加就能够起到预防或治疗作用呢？这有待我们进一步的研究。

从本研究结果中我们了解到阿司匹林可以引起各型SSTR的表达均降低，但是，内源性的SST并没有明显变化，也给我们提出了新的思考：SSTR可能受到了什么影响呢？SST广泛的分布于中枢及周围神经系统、消化系统、垂体、胸腺、输卵管、卵巢等[13]，影响其变化的因素很多。对SST表达有调节作用的细胞内因子主要有Ca2+、cAMP、cGMP和NO。其中，cAMP对SST表达和分泌都有促进作用,因而是调节SST功能最重要的信号转导途径。在本组实验中SST没有变化，提示我们这些因素可能没有受到影响，或是各种变化的因素之间相互抵消了引起SST的变化。SSTR结构上是完整的糖蛋白，通过G蛋白与腺苷酸环化酶、钾离子通道、钙离子通道相偶联,作用于细胞内相应的效应系统[14]。SSTR的表达下降是否是非甾体消炎药影响了其与G蛋白的偶联或是非甾体消炎药对肠黏膜的损伤，破坏了其完整的蛋白结构，有待我们进一步研究。

NSAIDs广泛用于临床，可以有不同的用药途径，不同的用药途径之间有没有差别呢？从本实验数据还可观察到，在不同方法处理组之间生长抑素受体的表达不完全相同，与空白对照组比较，腹腔注射组SSTR1、SSTR2、SSTR3的表达较空白对照组降低，但没有差异性。与灌胃组及灌肠组比较,腹腔注射组SSTR1，SSTR2及SSTR3的表达要高，有差异性。提示我们：一方面不同的给药途径对各型生长抑素受体的表达的影响不尽相同；另一方面，腹腔注射阿司匹林对SSTR表达的抑制作用较低是否与此种给药途径的阿司匹林生物利用度较低有关。根据数据显示灌胃组、灌肠组的SSTR1、SSTR2、SSTR3的表达下降较腹腔注射组明显，但是，在SSTR4和SSTR5的表达中却没有类似的结果，其原因还有待我们进一步的思考及研究。

综上所述，NSAIDs(阿司匹林)不同给药途径均可导致大鼠小肠黏膜损害，损伤程度可能与药物的种类、剂型及用药时间相关。各型SSTR在小肠黏膜重叠表达，以SSTR1、SSTR2为主。NSAIDs可以使各型SSTR的表达下降，减弱SST的作用，从而破坏肠道黏膜屏障功能，造成肠道黏膜的损伤，引起相应的临床症状。不同的给药途径对SSTR的影响不尽相同，提示我们可否通过提高SSTR的表达或者采用不同的给药方式减少肠道损伤的发生。通过本研究也给我们提出了新的问题：SSTR可能受到了什么样的影响？是什么因素造成了不同的给药途径对各型SSTR的影响不一致？不同的给药途径的阿司匹林生物利用度是否受影响？通过人为的干预SSTR的表达是否能达到预防NSAIDs对小肠黏膜的损害预期？这些问题都有必要进一步深入研究。

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[收稿2015-05-15修回2015-09-15]

(编辑许四平)----------------------------------------------

Effect of aspirin on somatostatin receptors level in SD rat′s intestinal mucosa

YANGTian-Fei，ZHENTong，TANQing-Hua,CHEZhu-Ping.TheFirstAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China

[Abstract]Objective:To investigate the optimal administration approach of using aspirin by observing the effects of the rats intestinal mucosal barrier and somatostatin receptors level with different administration approaches of using non-steroid anti-inflammatory drugs-aspirin.Methods: 32 SD rats were randomly divided into 4 groups:oral intake group,enema group,intraperitoneal injection group and control group.Every group had 8 rats.The ileum mucosal injury was scored.The level and distribution of SSTRs in every group was detected by ELISA and immunohistochemistry,respectively,The IOD score in each group was measured by image analysis.Results: (1) The scores of ileum mucosal injury in aspirin experimental groups were significantly higher than that in control group (P<0.05),but there were no difference among aspirin experimental groups.(2) All subtypes of SSTR were expressed in rat intestinal mucosa.However,SSRT1 and SSTR2 were expressed mainly(P<0.05).(3) The expressions of SSTR1-5 on intestinal mucosa in aspirin experimental groups were significantly less than that in control group (P<0.05).(4) There was incompletely no same effects of SSTR1-5 in intestinal mucosa by different approaches (P<0.05).(5) There were no significant difference of SST concentration and IOD score among all groups (P>0.05).Conclusion: Aspirin can damage the rat intestinal mucosa.Aspirin could lead to the decrease of SSTR1-5 expression in the intestinal mucosa.All subtypes of SSTR in rat small intestine mucosa were expressed,suggesting that aspirin could affect the barrier function of the intestine.There were different influences on SSTR1-5 expression by different administration approaches，suggesting aspirin by parenteral approach may reduce the intestinal damage.

[Key words]Intestinal Mucosa；Aspirin；SSTR1-5；Approach

通讯作者及指导教师：谭庆华(1968年-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事消化内镜研究，现工作于四川华西大学医院，E-mail:tanqh2007@163.com。

作者简介：杨天飞(1975年-)，女，硕士，副主任医师，主要从事消化内科及消化内镜研究，现就职于贵州省贵阳市贵航贵阳医院，E-mail:1046567047@qq.com。

中图分类号R574.53

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0178-06