原头蚴对体外培养小鼠脾细胞中Th细胞亚群的影响①

方海瑞　蒋红群　徐芳洁　侯　隽　董　丹　陈聪哲　吴向未　陈雪玲

(石河子大学医学院免疫学教研室，石河子832002)

原头蚴对体外培养小鼠脾细胞中Th细胞亚群的影响①

方海瑞蒋红群徐芳洁侯隽董丹陈聪哲吴向未②陈雪玲

(石河子大学医学院免疫学教研室，石河子832002)

[摘要]目的：观察原头蚴对体外培养小鼠脾细胞中Th细胞亚群及相关细胞因子表达的影响。方法：BALB/c小鼠脾细胞与原头蚴共培养，用ELISA检测上清液IL-4、IFN-γ、TGF-β含量；同时收集细胞用FCM检测Th细胞亚群。结果：ELISA检测不同感染时间原头蚴组IL-4、TGF-β分泌均增加，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；FCM检测原头蚴组不同时间点Th2、Treg细胞的比例，差异均有统计学意义(P<0.05)，但Th1细胞不同时间点组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：原头蚴能刺激体外培养的小鼠脾细胞向Th2、Treg细胞分化且上调相应细胞因子的分泌，提示这些亚群细胞可能在包虫病感染的免疫逃逸中发挥一定作用。

[关键词]原头蚴；脾细胞；Th细胞

包虫病或称棘球蚴病(Hydatid disease)，由细粒棘球绦虫幼虫(也称棘球蚴或包虫) 寄生在人畜体内而引发的是一种人畜共患寄生虫病，主要分布于牧区[1]。以细粒棘球蚴引起的囊型包虫病多见。细粒棘球蚴长期寄生于宿主体内，对宿主造成不同程度的伤害[2]。其次，当包囊意外破裂，部分原头节可能进入组织内，造成再次感染，给包虫病的治疗带来很大困难[3]。虫体之所以能在宿主体内长期生存，有赖于对宿主的免疫逃避功能。目前关于虫体免疫逃逸的研究集中在临床体内患者观察或者试验研究，IL-2 及 IL-4、IL-10等Th1/Th2 细胞因子的表达量变化，进而提示 Th1/Th2 的平衡应答模式改变可能产生的免疫逃避方式[4]。本研究通过在体外利用小鼠脾细胞和细粒棘球蚴原头蚴共培养，流式细胞仪检测 Th细胞比例及ELISA检测培养上清液中细胞因子含量的变化，探讨体外原头蚴对小鼠 Th2、Th1、Treg细胞及相关细胞因子的影响，为进一步阐明包虫病早期免疫逃逸提供新的实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料雌性 BALB/c 小鼠，6 ～ 8 周，购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心。

1.1.2主要试剂和仪器RPMI1640 培养基，胎牛血清(FBS) 均购自 Hyclione 公司；流式抗体 CD3-FITC、CD4-PE、IL-4-APC、IFN-γ-APC、Foxp3- eFluor660均购自ebioscience 公司； IL-4、IFN-γ 、TGF-β酶联免疫法(ELISA法)试剂盒购自中国达科为公司。破膜剂、固定剂均购自美国eBioscience 公司；佛波酯 (PMA)、离子霉素 (Inomycin)、莫能霉素(Monensin)、BFA购自北京联科公司；小鼠淋巴细胞分离液购自Solarbio 公司。

1.2方法

1.2.1细粒棘球蚴原头蚴的制备从感染细粒棘球蚴病的羊肝上无菌抽取无钙化、无感染、完整的单囊型细粒棘球蚴包囊内容物，置于无菌离心管内，待原头蚴(Protoscolex,PSC)自然沉淀后用含有100 U/ml青霉素和链霉素双抗的无菌PBS(pH7.30)漂洗3次，除去育囊碎片，使其自然沉淀，经0.5%伊红染色5 min，在显微镜下鉴定具有活性的虫体数(>90%)，用含双抗的无菌PBS稀释成浓度为1 000个/ml的原头蚴悬液，备用。

1.2.2小鼠脾脏细胞分离脱颈处死小鼠，无菌摘取脾脏，用1支2.5 ml和1支1 ml注射器在含有少许PBS的小平皿中刮出脾细胞。用1 ml注射器抽吸刮出的脾细胞3～5次，使脾细胞尽量分散。向1新离心管加入3 ml小鼠淋巴细胞分离液，再将约1.5 ml脾细胞悬液缓慢加入(两者的体积比为2∶1)，以2 000 r/min(离心半径13 cm)离心20 min，取出中间的云絮层(淋巴细胞层)，用3 ml PBS重悬后以1 000 r/min(离心半径13 cm)离心5 min。重复洗涤2～3次。最后将沉淀细胞悬浮于1 ml 1640培养基中，进行细胞计数，配成细胞数为2×107~3×107个/ml，备用。

1.2.3不同作用时间原头蚴对小鼠Th子集及相关细胞因子的影响(1) 制备好的脾细胞悬液加入到6孔板里，每孔0.5 ml，再加入1 000个/ml原头蚴0.5 ml(0.5 ml 1640为对照组)，每个时间点设3 个复孔;并依次加入佛波酯、离子霉素、莫能霉素，使其终质量浓度为4 μl/m1，37℃，5% CO2培养，分别在12、24、36、48 h收集细胞，2 000 r/min 离心5 min，收集细胞，PBS 洗涤2遍，之后加入流式表面抗体孵育30 min，随后细胞固定、破膜、胞内染色，用于流式细胞仪检测 Th细胞亚群变化。(2)制备好的脾细胞悬液加入到6孔板里，每孔0.5 ml，再加入1 000个/ml原头蚴0.5 ml(0.5 ml 1640为对照组)，每个时间点设3 个复孔，各孔加入ConA，使每孔的ConA 浓度为10 μg/ml。分别在12、24、36、48 h后离心收集上清液。

1.2.4ELISA 检测上清液中相关细胞因子的含量 按ELISA试剂盒说明书操作。

2结果

2.1原头蚴与小鼠脾细胞共培养，不同时间点Th2细胞数量增加通过流式细胞仪检测CD4+IL-4+细胞的比例，结果显示，在24、36、48 h实验组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2原头蚴与小鼠脾细胞共培养，不同时间点CD4+Foxp3+细胞数量增加通过流式细胞仪检测CD4+Foxp3+细胞的比例，结果显示，在24、36、48 h实验组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3原头蚴与小鼠脾细胞共培养，不同时间点Th1细胞数量无改变通过流式细胞仪检测CD4+IFN-γ+细胞的比例，结果显示随着体外培养时间的延长，Th1细胞的比例在实验组和对照组之间没有统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4原头蚴与小鼠脾细胞共培养，细胞因子IL-4升高、IFN-γ先升后降采用 ELISA 法检测小鼠脾脏细胞培养上清中IL-4 、IFN-γ浓度，随着培养时间的增加上清液中IL-4的浓度是增加的，在各个时间点实验组和对照组差异均有统计学意义(P<0.05)；而IFN-γ的浓度是先增高在下降，实验组和对照组均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

2.5原头蚴与小鼠脾细胞共培养，细胞因子TGF-β升高采用 ELISA 法检测小鼠脾脏细胞培养上清中TGF-β浓度，随着培养时间的增加其上清液的浓度是增加的，实验组和对照组差异有统计学意义。(P<0.05)。见图5。

3讨论

宿主抗细粒棘球蚴感染的免疫应答是一个复杂的进程，T 淋巴细胞在细粒棘球蚴与宿主关系上发挥着重要作用[5，6]。不同的抗原进入机体优先激活的Th细胞不同,其直接决定了机体对抗原免疫应答的方向和结果[7]。棘球蚴病的免疫是免疫保护和免疫损伤并存的机制,其中以细胞免疫造成的保护和伤害为主[8]。因此Th细胞作为免疫应答最重要的调节细胞,在机体的抗虫免疫中起着极为关键的作用。本研究通过FCM检测了体外共培养脾细胞和原头蚴后，Th1、Th2、Treg细胞以及相关细胞因子在细粒棘球蚴感染中的表达。通过FCM可以看出Th1细胞数量没有变化，其实验组的数量高于对照组但是没有统计学意义，培养的上清液中IFN-γ水平先升后降，可能是一开始原头蚴和脾细胞接触刺激了IFN-γ的产生，抑制原头蚴的生长，但随着刺激时间的延长，IL-4分泌增加，可能抑制了IFN-γ的产生，使之数量减少，促使了虫体的免疫逃逸。

Treg细胞是一种具有免疫调节功能的CD4+T 细胞，在维持机体内外的免疫耐受方面有着重要的作用。CD4+CD25+Foxp3+是研究较为成熟的 Treg 细胞表型标记，Foxp3 是其最特异性的转录因子，对 Treg 细胞分化成熟和功能的发挥具有重要意义[9]。在本实验中我们用FCM检测了CD4+Foxp3+的表达量发现随着培养时间的增加，其含量是增加的，说明可能CD4+Foxp3+细胞在体外棘球蚴感染中可以减弱及抑制脾细胞分泌IFN-γ，对虫体有一定的保护作用。

实验结果显示感染后，Treg细胞、Th2细胞和细胞因子IL-4水平均随着感染时间的增加而上升，差异有统计学意义，提示感染时间对 T细胞亚群变化及其细胞因子的产生有一定的影响，但影响程度有限。本实验我们检测了CD4+Foxp3、Th1和Th2细胞在体外不同时间点的分布表达量，三者之间的联系有待进一步的研究，同时三个亚群细胞分泌细胞因子的量也有所差异。

本实验通过FCM体外检测不同时间点脾细胞与原头蚴共培养后Th细胞亚群的表达，发现随着感染时间的增加，Th2细胞和Treg细胞的比例有所增加，这些亚群细胞可能在原头蚴免疫逃逸中有一定的联系。吐尔洪江等[10]在血清分析时发现，包虫病组Treg细胞相关细胞因子IL-10和TGF-β显著高于健康对照组,提示包虫感染可能通过刺激 Treg细胞加强对宿主的免疫抑制作用。我们通过用ELISA检测上清液中细胞因子水平发现，IL-4以及TGF-β都有增加的趋势，原头蚴促进脾细胞TGF-β的表达，可能通过抑制淋巴细胞的免疫功能，发挥对宿主的免疫逃避作用[11]。有研究结果显示IL-4/IL-10可以削弱Th1细胞的保护性免疫应答从而使原头蚴可以在宿主体内存活[12-14]。在本研究中细胞因子IL-4、IL-10的水平增加，可能符合这一观点，此外还可以 表明在原头蚴感染期间可能有多种细胞因子参与了调节，但其具体作用需要进一步的研究。TGF-β具有双重作用，生物活性复杂多样，既可通过介导免疫应答发挥抗寄生虫作用，引起宿主一系列病理损伤，也可使机体处于免疫抑制状态，有助于寄生虫逃避宿主的攻击[15]。本实验结果与TGF-β在血吸虫中的表达趋势相一致，都是为了提高TGF-β的表达量以逃避宿主的免疫应答，TGF-β在Th细胞及相关细胞因子的分化表达中扮演不同的作用，在本实验中TGF-β可能联合IL-4抑制了IFN-γ的产生，促进了虫体在体外的存活。

细粒棘球蚴的免疫病理是多种细胞及多种细胞因子相互作用、相互调节的结果，该实验对进一步深入研究细粒棘球蚴的免疫逃逸奠定了基础。

参考文献：

[1]Carmena D，Sanchez-Serrano LP,Barbero-Martinez I.Echinococc-usgranulosus infection in Spain[J].Zoonoses Public Health,2008,55(3):156-165.

[2]Zhang WB,Wen H,Li J,etal.Immunology and Immunodiagnoisis of cystic echinococcosis:an update[J].Clin Dev Immunol,2012：101895.

[3]Baz A,Ettlin GM,Dematteis S.Complexity and function of cytokine responses in experimental infection by Echinococcus granulosus[J].Immunobiology,2006,211(1/2):3-9.

[4]Jankovic D,Liu Z,Gause WC.Th1- and Th2-cell commitment during infectious disease:asymmetry in divergent pathways[J].Trends Immunol,2001,22(8):450-457.

[5]Dai WJ,Waldvogel A,Siles-Lucas M,etal.Echinococcus multilocularis proliferation in mice and respective parasite 14-3-3 gene expression is mainly controlled by an alphabeta CD4 T-cell-mediated immune response[J].Immunology,2004,112(3):481-488.

[6]王丽婷,马红,贾继东.瘦素对肝纤维化作用机制的研究进展[J].基础医学与临床,2006,26(1):42-45.

[7]沈蕾,张兆松.CD4+T细胞与血吸虫感染的保护性免疫[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2001,19(3):246-249.

[8]李富荣.细胞因子在棘球蚴感染、治疗评价中的作用[J].国外医学:寄生虫病分册,1999,7(4):145-147.

[9]Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(4):330-336.

[10]吐尔洪江·吐逊,单骄宇,李涛,等.Th17细胞和调节性T细胞在肝包虫病免疫逃避中的作用[J].中华消化外科杂志,2010,9(4):283-286.

[11]陈小林,印双红,吴向未,等.原头蚴及囊液促体外培养小鼠脾细胞TGF-β表达的研究[J].中国病原生物学杂志,2013,8(6):523-526.

[12]Vuitton DA,Gottstein B.Echinococcus multilocularis and its intermediate host:a model of parasite-host interplay[J].Biomed Biotechnol,2010,2010:923193.

[13]Chandrasekhar S,Parija SC.Serum antibody & Th2 cytokine profiles in patients with cystic echinococcosis[J].Indian J Med Res,2009,130(6):731-735.

[14]Mezioug D,Touil-Boukoffa C.Cytokine profile in human hydatidosis:possible role in the immunosurveillance of patients infected with Echinococcus granulosus[J].Parasite,2009,16(1):57-64.

[15]Zhang S,Hüe S,Sène D,etal.Expression of major histocompatibility complex class I chain-related molecule A,NKG2D,and transforming growth factor-beta in the liver of humans with alveolar echinococcosis:new actors in the tolerance to parasites?[J].J Infect Dis,2008,197(9):1341-1349.

[收稿2015-06-14修回2015-07-28]

(编辑许四平)

Effect of protoscolex on T subsets in mice spleen cells in vitro

FANGHai-Rui,JIANGHong-Qun,XUFang-Jie,HOUJun,DONGDan,CHENCong-Zhe,WUXiang-Wei,CHENXue-Ling.DepartmentofImmunologyofMedicalSchool，ShiheziUniversity，Shihezi832002，China

[Abstract]Objective:To observe the effect of protoscolex on Th subsets and correlative cytokine in mice spleen cells in vitro.Methods: Co-culture spleen cells from BALB/c mice with protoscolices,then IL-4,IFN-γ and TGF- β production in cell culture supernatants were analyzed by ELISA.The percentage of Th subsets were detected by Flow Cytometry analysis.Results: Secretion levels of IL-4 and TGF-β were significantly increased in spleen cells at different time point in co-culture system with protoscolices.Ratios of Th2 and Treg cells were also significantly increased in co-culture system at different time points than the control groups.However,there was no statistical significance for ratio of Th1 cells at different time points.Conclusion: The protoscolex can increase the ratios of Th2 cells and Treg cells from spleen cells.Secretion levels of IL-4 and TGF-β were also increased in spleen cells co-cultured with protoscolices.The results suggest that these Th cell subsets play a role in the immune escape of the hydatid disease.

[Key words]Protoscolex;Spleen cells;Th cells

通讯作者及指导教师：陈雪玲(1971 年-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事感染免疫方面的研究，E-mail:xuelingch@ hotmail.com。

作者简介：方海瑞(1988年-)，女，在读硕士，主要从事地方感染性疾病方面的研究，E-mail:fhrharry1120@163.com。

中图分类号R383.33
①本文受国家自然科学基金(No.81260412)、国家自然科学基金(No.81360453)资助。
②石河子大学第一附属医院肝胆外科，石河子832002。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0174-05