评估人T淋巴细胞亚群对结核杆菌脂质抗原的免疫反应①

金　亮　张　茜　李柏青　沙　泉

(安徽医科大学免疫学教研室及过敏与免疫研究中心，合肥230032)

评估人T淋巴细胞亚群对结核杆菌脂质抗原的免疫反应①

金亮张茜李柏青沙泉

(安徽医科大学免疫学教研室及过敏与免疫研究中心，合肥230032)

[摘要]目的：观察结核杆菌脂质的一些脂类抗原对人外周血中淋巴细胞活化和增殖的作用，进而探讨脂类抗原在结核感染中是否存在特异性的免疫作用。方法：取健康人外周血单个核细胞(PBMC)，分离诱导出非成熟树突状细胞(imDC)后分别加入结核杆菌脂质全脂质(TLIP)、丙酮可溶性脂质(ASLIP)、纯硫脂(PSLIP)、脂阿拉伯糖(LAM)、脂甘露聚糖(LM)、同时设置非脂类抗原全菌裂解物(WCL)、培养分泌蛋白(CFP)、耐热抗原(Mtb-HAg)、脂多糖(LPS)和空白对照组。用CFSE标记自体淋巴细胞后，与被脂质抗原刺激后的DC共培养。之后，用流式细胞仪(FCM)检测T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、NKT和 γδT)的增殖和分泌细胞因子( IFN-γ、TNF-α和 IL-4)的情况。结果：相较于空白组，所有脂质都能促进NKT细胞和CD8+T细胞增殖(P<0.05)。相较于空白组ASLIP，LAM和LM可以促进非增殖的CD4+T细胞分泌IL-4，或者促进增殖的CD4+T细胞分泌IFN-γ(P<0.05)。相较于空白对照组，所有脂质抗原(除了LM)都能促进增殖的γδT和 CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α，而LM能抑制增殖的CD8+T细胞分泌TNF-α。结论：结核杆菌脂质抗原能激活PBMC的特异性免疫反应，特别是CD1限制性T细胞的应答。

[关键词]结核杆菌脂质抗原；细胞因子；T淋巴细胞亚群；增殖反应

结核病是严重危害人类生命健康的传染病，据世界卫生组织(WHO)2014年报告，全世界估算每年新增850万结核患者，有约140万人死于结核病，中国占新增病例数的12%，仅次于印度(26%)居世界第二位[1]。目前研究表明，T细胞和其表面分子主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ和Ⅱ参与了保护性免疫在宿主对M.tb的蛋白抗原反应中[2]。因此，很多候选的疫苗都是通过M.tb的蛋白抗原作用于免疫细胞后，诱导出潜在的Th1反应[3]。虽然M.tb拥有一层独特的，包含丰富脂类成分的细胞壁，但是，是否脂类成分能够潜在地成为一种预防M.tb的疫苗，目前还很少有人知道。最近研究发现，CD1限制性T细胞识别来源于M.tb细胞壁的脂类抗原，在宿主细胞介导免疫反应中具有极其重要的作用。CD1限制性T细胞具有与MHC限制性T细胞极其相似的功能，同时在天然免疫应答中具有独特的作用[4]。人类的CD1分子是一群抗原呈递分子包含CD1a、b、c、d和e，这些分子结合脂质，然后呈递他们给特异性的T细胞。CD1a、b和c 主要表达在CD4+、CD8+双阳性的胸腺细胞内以及外周血内抗原呈递细胞(APC)，例如DCs、单核细胞。此外在一些B细胞亚群内也有表达[5]。此外，来源于PBMC的非成熟DC(imDCs)通过与白介素4(IL-4)和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)培养诱导后，能够持续的表达这些分子[6]。目前用M.tb脂质制作的疫苗在guinea猪内实验表明，其在抗M.tb方面有强烈的保护性免疫作用[7]。同时也已经发现CD1限制性T细胞能够通过分泌大量细胞因子(例如肿瘤坏死因子、γ干扰素等)发挥保护性免疫[8]。所以我们的研究目的是为了进一步探究健康人群对M.tb脂类片段的免疫反应时，T细胞亚群(γδ T 细胞、NKT 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞)发挥的功能和特性，以此来评价脂类抗原作为新型预防结核疫苗组分或者结核治疗靶点的可能性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 M.tb抗原制备由M.tbH37Rv株制备的全菌裂解物(WCL，NR-14822)、全脂质(TLIP，NR-14837)、丙酮可溶性抗原(ASLIP，NR-14842)、纯硫脂(PSLIP，NR-14845)、脂阿拉伯糖(LAM，NR-14848)、脂甘露聚糖(LM，NR-14850)和培养分泌蛋白(CFP，NR-14825)均由BEI Resources，美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)，美国国立卫生院(NIH)提供。根据BEI提供的方法，我们溶解这些抗原按照恰当的浓度，冻存于-80℃备用。脂多糖(LPS)从Sigma购买，在-20℃冻存。结核杆菌耐热抗原(M.tb-HAg)由蚌埠医学院感染与免疫实验室提供，根据先前的制备方案进行制备[9]。

1.1.2细胞的准备抽取健康志愿者外周血样品，用Ficoll液(天津生物)根据密度离心分离出PBMC，并用RPMI1640(Gibco)洗涤三次。PBMC用台盼蓝检测细胞活力，并且计数后，用完全RPMI1640(包含10%胎牛血清，50 U/ml青霉素，均是Gibco)重悬。在培养箱内，将细胞放置在塑料制的培养皿内培养3 h。将非黏附PBMC分离出后，用冻存液(15%DMSO和85%完全1640)重悬后，冻存于液氮罐内。而黏附PBMC继续用完全1640培养并且加入200 U/ml 白细胞介素4(IL-4，Perprotech)和400 U/ml人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，Perprotech)。培养至第3天，半量换液，补加同剂量细胞因子。至第6天，这些imDC用EDTA消化细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后，计数。在培养前和培养后，我们用FCM(Verse，BD)分别检测抗原表位CD14、CD1a和CD11c的变化。

1.2方法

1.2.1树突状细胞成熟度检测被诱导成功的imDC用完全1640培养液重悬后，被分布在24孔板内，50 000/孔。每孔分别加入10 μg/ml (WCL、TLIP、ASLIP、LAM、LM或PSLIP)，5 μg/ml (CFP 或M.tb-HAg )和 1 μg/ml LPS以及空白对照组。在培养箱内共培养2 d后，取样，用FCM检测细胞的抗原表位标志CD83。

1.2.2T细胞亚群的增殖和分泌细胞因子的检测非黏附的PBMC被复苏后用CFSE标记(终浓度为 1 μmol/L)，用含10%人AB型血清(Gibco)的完全1640[10]重悬后，按照20∶1比例分别放入被抗原刺激过的DC培养孔内(终浓度为1 000 000/孔)。在培养箱内培养9 d，每3 d半量换液，并加入25 U/ml 白细胞介素2(IL-2，Sigma)。至第9天，培养孔内加入10 ng/ml的PMA(Phorbo 12-myristate 13-acetate，Sigma)和500 ng/ml 的IM(Ionomycin，Sigma)，在培养箱内培养2.5 h，之后加入莫能霉素(Monesin，Sigma)继续培养4 h。最后细胞被收集洗涤后，先用流式抗体(Biolegend,Miltenyi,BD,Invitrogen 和 eBioscience)标记CD3、CD4、CD8、γδT和NKT，室温下避光25 min。细胞再次被洗涤后，加入透膜液(Cytoperm buffer，BD)在室温下静置30 min后，被透膜的细胞用流式细胞抗体IFN-γ (Biol-egend)、IL-4 (Biolegend)和TNF-α (Biolegend)胞染后，继续在室温下静置30 min。处理后的细胞用PBS洗涤3次后，用含2%PFA(Paraformaldehyde )的PBS调整细胞浓度106每管细胞后，用FCM(Verse，BD)检测。数据用Flow Jo软件分析。单核细胞首先被圈出，接着圈出CD3+CD4+T、CD3+CD8+T和CD3+γδT 亚群细胞，之后圈出各亚群细胞在CFSE-的增殖细胞比例。同时为了确定增殖细胞分泌细胞因子的比例(图1)，我们用十字线确定CFSE-IL-4、CFSE-TNF-α或者CFSE-IFN-γ。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0软件进行t检验或者方差检验，P<0.05具有统计学意义。

2结果

2.1树突状细胞的成熟度和分化检测黏附细胞在IL-4和GM-CSF诱导下，培养至第6天后，其表达CD14的细胞比例相较于培养前明显下降，而表达CD1a的细胞比例相较于培养前有明显上升。imDCs被各种抗原刺激后，用FCM检测CD83+细胞的表达比例，相较于空白对照组(17.8±6.8)%，WCL(35.9±5.04)%、TLIP(41.8±11.8)%、SLIP(38.2±11.7)%、ASLIP(50.3±11.5)%、LAM(43.47±14.9)%、LM(40.47±2.4)%、M.tb-HAg(30.8±5)%、LPS(41.6±14.3)%均升高(图2A、B)。

2.2T细胞亚群增殖检测在培养9 d后，运用FCM检测被CFSE标记过的T细胞亚群的增殖比例。我们首先发现CFSE-CD4+T细胞的比例在各组内相较于空白对照组无明显差异(P> 0.05)。其次CFSE-CD8+T 细胞的比例，相较于空白对照组(65.71±10.4)%，WCL (83.4±3.3)%、TLIP (81.95±2.3)%、AS LIP (83.9±2.52)%、PSLIP(83.57±7.1)%、LAM (78.92±4.8)%、LM(83±4.95)%、CFP (84.4±6.2)%、M.tb-HAg(83.65±5.2)%和 LPS(84.15±7.5)%均升高(P<0.05)。最后CFSE-NKT+细胞比例，相较于空白对照组(1.7±0.74)%，在WCL (3.91±0.94)%，TLIP

(3.31±0.92)%，ASLIP (2.78±1.21)%，PSLIP (3.41±0.93)%，LAM(3.66±2.1)%，LM(3.12±0.48)%，CFP(3.03±1.58)%，M.tb-HAg (3.34±1.6)%和LPS(3.6±1.8)%的比例均要高(P<0.05)，见图3。

2.3T细胞亚群分泌IFN-γ、IL-4、TNF-α的检测淋巴细胞经不同的抗原刺激培养至9 d后，用FCM检测分泌IFN-γ、IL-4和TNF-α的增殖部分的细胞比率。

2.3.1TNF-α分泌情况①产生TNF-α的CFSE-CD8+T细胞比例，相较于空白对照组(26.5±5.5)%，WCL(45.9±6.9)%、TLIP(36.5±4.4)%、ASLIP(45.9±8.2)%、PSLIP(32.7±4.8)%、LAM(34.4±7.9)%、M.tb-HAg (37.9±2.7)% 均高于空白对照组(26.5±5.5)%，但是LM组(20.3±6.7)%却要低于空白组对照组(P<0.05)。②TNF-α的CFSE-γδT+细胞比例TLIP(24.9±5.1)%、ASLIP(30±9.3)%、PSLIP(24.3±5.6)%、LAM(24.4±11.8)%、CFP(21.98±3.6)%、LPS(21.7± 9.6)%均高于空白对照组(13.3±2.2)%(P<0.05)。CFSE-CD4+T细胞没有任何差异(P> 0.05)(图4)。

2.3.2IFN-γ分泌情况①产生IFN-γ 的CFSE- CD8+T细胞比例，相较于空白对照组(5.6±2.4)%，WCL(14.4±5.9)%、TLIP(12.3±6.5)%、ASLIP(15.3±7.3)%、PSLIP(12.2±6.6)%、LAM(16.6±6.9)%、LM(15.4±5.1)%、CFP(16.5±7.4)%、M.tb-HAg(18.9±6.1)%和LPS(13.1±5.6)%均升高(P<0.05)。②产生IFN-γ 的CFSE-γδT+细胞比例，相较于空白对照组(2.9±2.3)%，下列各组WCL

(12.2±7.2)%、ASLIP(12.7±7.8)%、PSLIP(13±7.7)%、M.tb-HAg (19.2±11.5)%、LM(9.6±4.8)%和LPS(12.4±5.8)% 均升高(P<0.05)。③产生IFN-γ的CFSE-CD4+细胞比例，相较于空白对照组(3.9±2.4)%，WCL(9.4±5.2)%、TLIP(11.2± 5.9)%、ASLIP(11.9±6.2)%、PSLIP(10±4.7)%、LAM (11.5±5.2)%、LM (10.9±7.3)%、CFP(12.3±7.5)%、M.tb-HAg(15.7±7.5)%和LPS(11.2±8.1)%均要升高(P<0.05)。所以，LM能够促进CD8+T细胞分泌IFN-γ 同时却能抑制TNF-α的分泌(图5)。

2.3.3IL-4分泌情况我们发现产生IL-4的CFSE-CD4+T细胞比例在各组与空白对照组相比，无显著性差异(P> 0.05)。但是，相较于空白对照组(10.3±2.1)%，产生IL-4的CFSE-CD4+T细胞比例在WCL(12.9±2)%，ASLIP(13.6±0.8)%，LAM(12.2± 1.8)%，LM(11.7±1.2)%，CFP(14.±0.7)%，M.tb-HAg(15.2±2.7)%和LPS(15.7±1.6)% 均升高(P<0.05)(图6)。所以ASLIP、LAM和LM能够促进未增殖的CD4+T细胞分泌IL-4，同时促进增殖的CD4+T细胞分泌IFN-γ。

3讨论

M.tb富含大量的脂质成分，且脂质能够涉及TB的免疫病理路径。当前的研究之一就是调查CD1限制性脂质抗原成为潜在疫苗的可能性。许多实验已经表明，来源于M.tb细胞壁的脂质抗原能够被表达CD1a、b或者c的已经受M.tb感染的APCs吞噬，进而呈递给分泌Th1细胞因子的T细胞和细胞毒性T细胞(CTL)[4]。我们的实验也证明了，这些脂质能够促进CTL和Th1细胞分泌IFN-γ和TNF-α。不过我们还发现这些细胞是CFSE表达阴性的，也就是说他们不仅受到活化，而且还大量的增殖。比如在我们的实验中，受脂类抗原刺激过的 CD8+T 细胞就能产生大量的IFN-γ和TNF-α并且发生明显增殖。此外，大量研究发现γδT细胞可以识别CD1分子，比如，一些表达Vd1-TCR的T细胞亚群能够在缺乏外源性脂类抗原情况下，识别CD1分子和自我反应。NKT细胞似乎有一个重要的、潜在的作用在宿主抵抗M.tb免疫反应中。重要的是，对NKT细胞的研究能够提供一个模板去更好的研究其他脂质限制性T细胞在人甚至其他哺乳动物中的作用[11,12]。但是NKT细胞的活化有两条路径，一条是通过外源性的抗原刺激引起的(直接活化)，而另一条则是首先DCs被脂类抗原刺激并且分泌IL-12，然后IL-12增强NKT细胞表面的TCR受体，从而活化NKT细胞(非直接活化)。目前，也已经有不少证据阐明，非直接活化路径涉及到免疫因子，这些免疫因子在许多脂类抗原免疫反应中扮演决定性的作用[14]。因此，在我们的研究中，先检测了被TB脂类抗原刺激后的DCs的成熟度标志CD83，再进一步检测NKT细胞的增殖情况。总而言之，在脂质被DC呈递给CD1限制性T细胞后，这些T细胞能够溶解受感染的细胞，从而能够控制细菌的增长[14]。最近的报道表明M.tb的脂质成分在宿主抵抗M.tb的体液免疫反应和交叉反应中同样也具有重要的作用[15]。我们也发现，脂类抗原ASLIP、LAM和LM既能够诱导Th2细胞分泌IL-4，同样也能促进Th1细胞产生IFN-γ。因此，这几个脂质抗原是非常值得进一步研究的。此外，一些调查研究发现，在体外培养M.tb的脂质时，使用与我们相类似的方法中，只有在TB病人的样本中，T细胞才能够被刺激增殖，而健康人的样本却并无这样的情况[16]。但是，我们认为，只要适当的延长培养时间，这些健康人的T细胞同样能够得到反应。虽然本实验中，这些脂质抗原可以被DC诱导成熟，但是不能确定这些DC具体的功能状态，比如是否是分泌IL-12从而诱导Th1细胞发生反应？此外非黏附PBMC中非T细胞(例如B细胞，NK细胞等)对脂质的反应也不太明确。这些都有待进一步的研究。总而言之，我们的实验初步表明了M.tb脂质抗原在CD1限制性T细胞的保护性免疫反应的这条路径，以及它的特异性免疫反应中具有重要的角色。

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[收稿2015-06-01修回2015-07-05]

(编辑倪鹏)

Evaluation of immune responses of human T lymphocyte subsets to Mycobacterium tuberculosis lipid antigens

JINLiang,ZHANGXi，LIBai-Qing,SHAQuan.DepartmentofMedicalImmunologyandAllergyandImmunologyResearchCenter,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

[Abstract]Objective:Some antigens of M.tb to culture with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) for assaying their proliferation and activation,so as to signify whether lipid antigens of M.tb have specific immune responses in host against M.tb infection or not.Methods: We treated PBMC with several lipid antigens of M.tb to explore the ability of these antigens to activate immunity in healthy individuals.We measured and analyzed cell proliferation by labeling cells with carboxyfluorescein succinimidyl amino ester (CFSE) and subjecting them to flow cytometry (FCM).The production of IFN-γ,TNF-α and IL-4 by T cell subsets (NKT,CD4+,CD8+,and γδT) from healthy donors was analyzed by FCM after stimulation with autologous immature dendritic cells pre-cultured with M.tb lipid antigens.The tested M.tb lipid antigens were the total lipid (TLIP),Acetone-Soluble Lipids (ASLIP),Purified Sulfolipid (PSLIP),Lipoarabinomannan (LAM) and Lipomannan (LM) levels.Medium free of lipid antigens(WCL,CFP,LPS,Mtb-HAg and blank) was used as a control.Results: We found the proportion of proliferative NKT and CD8+T cells significantly increased in all lipid groups (P<0.05).ASLIP,LAM and LM promoted non-proliferative CD4+T cells to secrete IL-4 and proliferative ones to secrete IFN-γ (P<0.05).All lipid antigens promoted both proliferative γδT cells and CD8+T cells to secrete IFN-γ and TNF-α,but the proportion of TNF-α-secreting cells in these populations decreased in the LM group (P<0.05).Conclusion: Lipid antigens may affect the CD1-restricted T cells of the host to fight M.tb infection.

[Key words]M.tb lipid antigens；Cytokine；T-Lymphocyte subsets；Proliferation responses

通讯作者及指导教师：沙泉(1968年-)，女，教授，硕士生导师，主要从事过敏与气道免疫方面的研究，E-mail:qsha2@163.com。

作者简介：金亮(1988年-)，男，在读硕士，主要从事免疫学方面研究，E-mail:740133167@qq.com。

中图分类号R329.4
①本文为国家自然科学基金(No.81273245)、安徽省国际科技合作计划(No.11030603027)。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0159-06