H9与HepG-2体外共培养上清对HepG-2增殖迁移及凋亡的影响①

何雪梅　郑良栋　张　婷　刘梦楠　冯　涛

(重庆医科大学基础医学院，重庆400000)

·基础免疫学·

H9与HepG-2体外共培养上清对HepG-2增殖迁移及凋亡的影响①

何雪梅郑良栋张婷刘梦楠冯涛

(重庆医科大学基础医学院，重庆400000)

[摘要]目的：研究胚胎干细胞H9与肝癌细胞株HepG-2共培养上清对肝癌细胞HepG-2增殖、迁移及凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法：体外共培养H9与HepG-2，于不同时间即12、24、36、48 h取得上清，并把不同浓度上清即20%、40%、60%、80%作用于HepG-2细胞，于倒置荧光显微镜下观察细胞的生长情况和形态变化；用MTS法检测不同浓度上清分别作用HepG-2细胞24、48 h后细胞的增殖情况；应用流式细胞术检测细胞的凋亡情况；用Hochest33258染色检测细胞的凋亡情况；Transwell小室法检测上清对细胞侵袭迁移的影响。结果：不同浓度的共培养上清液均对HepG-2细胞的增殖有一定的抑制作用，并且40%浓度及以上的浓度能明显促进肝癌细胞的凋亡，主要是早期和晚期凋亡，小室法也看出，上清对肝癌细胞的侵袭和迁移也具有明显的抑制作用,同时，上清对正常的肝细胞L02无明显的作用。结论：胚胎干细胞与肝癌细胞HepG-2共培养上清能够在体外明显抑制肝癌细胞HepG-2的增殖、迁移和侵袭，并且促进其凋亡，并且具有浓度依赖性，共培养时间越长，抑制效果越好。说明此上清具有一定的抗肿瘤效应。

[关键词]共培养上清;肝癌细胞HepG-2;胚胎干细胞H9;细胞增殖;细胞凋亡

原发性肝癌(Primary carcinoma of liver)，以下简称肝癌，是我国常见的恶性肿瘤之一。肿瘤的发生，一是由基因决定，二是取决于机体的免疫功能，免疫力下降或者免疫功能失调会导致肿瘤的发生[1，2]。从发生学角度来看，肿瘤细胞和胚胎干细胞在细胞的增殖、生长和分化等方面都有许多共同特点，尤其是它们都具有惊人的分裂和受原癌基因调控的能力，同时在肿瘤侵袭与胚胎着床过程中也有着近似的侵入方式及相关酶解蛋白分子的参与[3-6]，最早在2004年，Lightfoot等[7]报道鼠胚胎干细胞可以在体外抑制胰腺癌细胞的生长,国内董伟等[8]证明，在小鼠Lewis肺癌模型中接种胚胎干细胞能显著缓解机体的免疫抑制状态，诱导抗肿瘤免疫的产生，对实体肿瘤的生长和发展具有显著的抑制作用[9]。张弘等[10]报道人胚胎干细胞对卵巢癌生长的抑制作用，研究发现人胚胎干细胞对卵巢癌细胞的体内外生长有抑制作用。后晓南等[11]应用胚胎干细胞与肿瘤细胞在体外共培养体系，观察小鼠囊胚与肿瘤细胞共培养时生长行为，人肺癌细胞株A549对囊胚体外脱带、贴附及扩展的能力无显著性影响。肿瘤的发生、发展还与周围微环境密切相关，肿瘤细胞向周围微环境中分泌或接受微环境的分子信号，直接影响肿瘤细胞的分化、生长和侵袭，因而微环境也是肿瘤治疗的重要因素。尽管肿瘤的微环境一直被认为是阻碍肿瘤治疗的因素，但也不能否认特定的环境因素也有可能具有潜在的治疗肿瘤的作用[12]，近来有关胚胎干细胞影响肿瘤细胞的生物学行为的研究为治疗肿瘤提供了一种新的思路。本课题在总结前人研究工作的基础上，研究HepG-2肝癌细胞在体外刺激胚胎干细胞时，胚胎干细胞做出的一定的抗肿瘤作用，在细胞和分子水平探索其抗肿瘤作用的具体机制。通过建立胚胎干细胞-HepG-2肝癌细胞体外接触式共培养体系，观察和检测胚胎干细胞与HepG-2肝癌细胞之间的相互作用，及胚胎干细胞对HepG-2肝癌细胞的直接抑制作用。基于以上研究我们希望通过胚胎干细胞与癌细胞株共培养来研究其抗癌效应，并且进一步探究其抗癌效应的机制，为肿瘤的治疗找到一种新的生物治疗方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂高糖DMEM培养基、F12培养基(无丙酮酸钠)，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，胰蛋白酶购于美国Hyclone公司，磷酸盐缓冲液(PBS)、 二甲基亚砜(DMSO)由重庆医科大学基础研究所提供。MTS购于重庆荣达生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；Hochest33258购于碧云天生物技术公司： PSeasy培养基，干细胞传代工作液EDTA、Matrial胶，购于北京赛贝生物试剂公司。其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.1.2主要仪器培养箱，荧光倒置显微镜：Olympus，日本。超净工作台：SW-GY-IC标准型，苏州净化设备厂。CO2培养箱：SNA-320D型，日本。酶标仪：Bio-rad。

1.1.3细胞株及培养HepG-2、L02为贴壁细胞，为本实验室留种(购于中科院上海细胞库)，用贴壁细胞的培养方法。培养液为含10%胎牛血清的DMEM，常规培养、消化、传代。实验均用对数期细胞。胚胎干细胞为H9人干细胞系，购于北京赛贝生物公司，H9是James Thomson实验室在1998年建立的第一批人ESC[13]，广泛用于全球实验室各类干细胞研究，是被国际公认的标准细胞系，H9来自雌性胚胎，为贴壁细胞培养方式，培养基为无血清的E8培养基，用六孔板培养，Matril基质胶铺板，每天换液一次，待细胞边界融合80%左右开始传代，消化液用EDTA消化，轻轻吹打，冻存用90%E8培养基10%DMSO冻存液。

1.2方法

1.2.1共培养上清的提取[14，15]将培养好的HepG-2按2×104/孔提前种于24孔板内，于37℃、5%CO2饱和湿度的环境中贴壁生长12 h，待贴壁后吸掉培养基，将hEGCs用EDTA在37℃消化5 min，机械分割hEGCs克隆为大小相似的小细胞团，把HepG-2细胞接种到已铺有hEGCs细胞的培养孔中(10个细胞团/孔)做为实验组，用仅HepG-2和hESC的孔作为空白对照组，L02与胚胎干细胞组作为条件对照组，于12、24、36、48 h后收集上清液。

1.2.2上清对HepG-2形态的影响将处于对数生长期的HepG-2细胞按5×104ml-1细胞浓度，取100 μl种于96孔板中，24 h待细胞贴壁后，加入不同时间、终浓度为20%、40%、60%、80%的上清液共同培养，以不加药物的孔为对照组，48 h、60 h观察细胞的形态变化。

1.2.3MTS法研究上清对HepG-2细胞增殖的影响将处于对数生长期的HepG-2细胞按5×104ml-1细胞浓度，取100 μl种于96孔板中，24 h待细胞贴壁后，加入不同时间、终浓度为20%、40%、60%、80%的上清液共同培养，以不加药物的孔为对照组，每个药物浓度及对照组都设三个复孔。 培养箱中分别培养24、48 h后，每孔分别加入20 μl的MTS染色液，于37℃孵箱中孵育4 h，用酶标仪于490 nm下测定各孔吸光度，求平均值计算Inhibitory。用SPSS17.0软件对数据作曲线估计。实验重复3次，结果取平均值，以相对应的OD值表示细胞增殖能力的大小，绘制生长曲线。抑制率=(1-实验组吸光度/不加上清的阴性对照组的吸光度)×100%。

1.2.4Transwell侵袭及迁移实验按1∶5比例将Matrigel胶与无血清培养基配成基质胶，混匀后按50 μl/室加入Transwell小室中，37℃培养箱中孵育2~3 h使其固态化。消化HepG-2细胞，用无血清培养基清洗后重悬细胞，在上室中加入200 μl含1×105个细胞数的细胞悬液，下室中加入600 μl含10%血清的培养基，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后1%甲醛固定，0.1%结晶紫染色后擦去小室上表面的基质胶及细胞，在显微镜下随机选取5个视野，观察拍照并计数。Transwell细胞迁移实验不在小室中加基质胶，上室中加入200 μl 含3×104个细胞数的细胞悬液，其余操作步骤同侵袭实验。

1.2.5检测细胞凋亡的改变将HepG-2细胞接种于6孔板，每孔接种细胞3×104个。37℃、5%的CO2培养，24 h加入不同浓度的上清(分组：实验分为对照组和实验组，实验组加入不同浓度的上清，对照组不加药)。继续培养48 h后，胰酶消化收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，用流式细胞仪检测凋亡。

2结果

2.1上清对HepG-2细胞增殖的影响(表1、图1)为观察上清对肝癌细胞HepG-2的增殖抑制作用，实验使用不同浓度、不同时间段的上清处理HepG-2，MTS结果显示：20%浓度的48 h上清作用于肝癌HepG-2细胞的24、48 h的抑制率分别为22.09%、28.37%；40%浓度的上清作用于肝癌HepG-2细胞的24、48 h的抑制率分别为38.64%、40.83%。60%浓度的上清作用于肝癌HepG-2细胞的24、48 h的抑制率分别为46.60%、55.88%；80%浓度的上清作用于肝癌HepG-2细胞的24、48 h的抑制率分别为57.91%、62.85%。结果表明：各浓度组的共培养上清对人肝癌细胞株HepG-2细胞的抑制作用，强于对照组，经统计处理，除共培养12 h和20%的浓度对其影响差异不显著外(P>0.01)，其他组差异均有显著性(P<0.05)，综上可知，这种抑制作用与药物浓度及作用时间呈正相关，剂量越大、药物作用时间越长，抑制率越高(P<0.01或P<0.05)。而对L02细胞的抑制作用随着剂量增大、药物作用时间延长抑制率亦有增加的趋势，但差异无显著性(P>0.05)。

Note：Difference between concentration，1)P<0.05；2)P<0.01.Difference between time，3)P<0.05，4)P<0.01.

2.2上清对HepG-2形态的影响(图2)HepG-2肝癌细胞与胚胎干细胞接触式共培养上清作用于HepG-2肝癌细胞后，在倒置荧光显微镜下观察到肝癌细胞HepG-2形态学发生明显的变化，与空白对照组正常培养状态下(不加上清)的HepG-2肝癌细胞相比，实验组肿瘤细胞数量增加缓慢，细胞形态皱缩变形，细胞核周围多出现空泡，处于分裂相细胞明显减少，部分细胞出现老化或者死亡迹象，并且随着药物浓度的增加，现象越明显，细胞数量越少，并且细胞间连接少，细胞壁贴壁不牢靠，而未用上清的对照组细胞呈上皮型贴壁生长,细胞轮廓清楚,细胞间接触紧密,胞质中无异常颗粒出现,增殖旺盛具体见图2，综上可以发现，共培养上清能对肝癌细胞的形态产生很大的影响，并且具有浓度依赖性，浓度越高，抑制效果越好。

2.3Hoechst33258荧光染色凋亡细胞形态学变化经Hoechst33342 染色后，荧光显微镜下观察:对照组细胞结构清晰，细胞核饱满，呈均匀蓝色;上清组部分细胞细胞核致密浓染，固缩，细胞边缘处伴有凋亡小体产生等细胞凋亡特征，可知干细胞上清和共培养上清都能促进细胞的凋亡，但是共培养细胞组的凋亡率明显高于非共培养组，见图3。

2.4上清对肝癌细胞侵袭、迁移的影响上清可抑制 HepG-2 细胞的迁移、侵袭，其中平均穿膜细胞数明显低于对照组(P<0.05或P<0.01 );加上清组迁移、侵袭细胞数明显减少(P<0.01)。见图4、5。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡检测结果显示用流式细胞技术检测对照组与加入20%、40%、60%、80%浓度上清对人肝癌细胞株作用48 h后细胞的凋亡情况，对照组凋亡率为0.44%，四个用药组凋亡率分别为5.85%、11.08%、18.27%和20.9%，与对照组检测结果比较有统计学差异(P<0.05)，细胞早期凋亡率明显高于对照组(P<0.01)，而上清对L02细胞无明显的抑制作用，见图6。

3讨论

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC) 是世界五大恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。目前，癌症的治疗方法主要有以下几种：手术切除、放疗、化疗、中医中药治疗。总体而言这些方法的效果不太令人满意 。肿瘤的发生，一是由基因决定，二是取决于机体的免疫功能，免疫力下降或者免疫功能失调可能会导致肿瘤的发生，所以通过提高机体免疫功能来发挥抗癌作用成为新的抗癌药物的研究方向，同时，正常成人免疫功能早已定型，刺激正常人提高其免疫力是很困难的，故寻求有生命活力的干细胞及其受肿瘤细胞刺激产生的有效抗癌因子和免疫因子是很有意义的。近年来，作为恶性肿瘤第四种治疗模式的生物治疗研究得到蓬勃发展，取得了一系列可喜的成果，该领域的飞速发展为肿瘤治疗提供了新希望。它的优势在于靶向性强，特异性高，效果确切，毒副作用小，远期抗癌效果好。胚胎干细胞是目前所知最全能的细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，各种细胞自我调节方式及信号通路表达都是正常的。它与肿瘤细胞在某些调节信号上是相交叉的，鉴于此，我们猜想这种正常生长发育的胚胎干细胞在与肿瘤细胞作用过程中可以控制肿瘤细胞的生长，逆转其恶性的生物学活性。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡是为更好地适应生存环境而争取的一种死亡过程，具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制[16，17]。

本实验通过在体外共培养胚胎干细胞和肝癌细胞，给胚胎干细胞体外直接接触，刺激干细胞，再用这种体外作用过后的上清作用于肝癌细胞，研究对肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡的影响。从结果可以看出，不同浓度的共培养上清液均对HepG-2细胞的增殖有一定的抑制作用，并且40%浓度及以上的浓度能明显促进肝癌细胞的凋亡，主要是早期和晚期凋亡，小室法也看出，上清对肝癌细胞的侵袭和迁移也具有明显的抑制作用，同时，上清对正常的肝细胞L02无明显的作用。胚胎干细胞与肝癌细胞HepG-2共培养上清能够在体外明显抑制肝癌细胞HepG-2的增殖、迁移和侵袭，并且促进其凋亡，并且具有浓度依赖性，共培养时间越长，抑制效果越好。

说明此上清具有一定的抗肿瘤效应。我们猜测，由于胚胎干细胞有全能分化的特点，肝癌细胞在体外可能刺激干细胞分泌一些免疫因子，能够抑制肝癌细胞HepG-2的增殖、迁移和侵袭，并且促进肝癌细胞的凋亡。上清中的这些细胞因子抑制HepG-2细胞增殖、迁移和侵袭行为，进而限制肿瘤的生长、转移并诱导细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。由于抗肿瘤作用机制一般具有多途径、多靶点的特点，故其具体的作用机制有待进一步探讨。同时，上清中具体有哪些免疫成分，都有待下一步研究。这种生物治疗和从免疫的角度来治疗肿瘤，具有很大的研究意义，可能为肿瘤的治疗带来新的希望。

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[收稿2015-08-05修回2015-08-14]

(编辑倪鹏)

Research H9 and HepG-2 in vitro co-culture supernatants affect HepG-2 proliferation,migration and apoptosis

HEXue-Mei,ZHENGLiang-Dong,ZHANGTing,LIUMeng-Nan,FENGTao.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400000,China

[Abstract]Objective:To explore the influence of co-culture supernatant from embryonic stem cell H9 and hepatoma cell line HepG-2 on the proliferation,migration and apoptosis of hepatoma cell HepG-2.Methods: We conducted in virto co-culture of H9 and HepG-2,then obtained supernatants in 12 h,24 h,36 h and 48 h and let supernatants of different concentration,namely 20%,40%,60% and 80% to act on HepG-2 cells.We observed growth condition and morphological changes of the cells under an inverted fluorescence microscope.MTS method was employed to evaluate proliferation conditon of HepG-2 cells in 24 h and 48 h since supernatants of varied concentrations had been added.We applied flow cytometry to show the apoptosis of cells.We also detected apoptosis of cells using Hochest33258 chromosome.We probed influence of supernatants on migration of cells.Results: Co-culture supernatants of varied concentration all had inhibitive effect on proliferation of HepG-2 cells.Supernatants of concentrations higher than 40% promoted apoptosis, particularly early and late apoptosis of HepG-2 cells rather notably.Chamber method also revealed the supernatant′s inhibition to invasion and migration of HepG-2 cells,and it had no conspicuous effects on normal hepatocyte L02.Conclusion: Co-culture supernatant of embryonic stem cells and hepatoma cell HepG-2 significantly inhibits the proliferation,migration and invasion of hepatoma cell HepG-2 in virto while promoting its apoptosis.Its effectiveness is concentration-dependent and increases over time.These results prove the anti-tumor effectiveness of this supernatant.

[Key words]Co-culture supernatants;Hepatoma cell HepG-2;Embryonic stem cell H9;Cell proliferation;Apoptosis

通讯作者及指导教师：冯涛(1963年-)，男，硕士，教授，博士生导师，主要从事基因工程、肿瘤发病机理及基因治疗方面研究。

作者简介：何雪梅(1989年-)，女，硕士，主要从事生物化学与分子生物学方面研究，E-mail:609875364@qq.com。

中图分类号R3
①本文为国家自然科学基金面上项目(No.81071770，81201679)。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0154-06

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.002 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.003