核转录因子E2相关因子2和Keap1的分子结构和功能及其信号通路调控分子机制研究进展

王朝阳，荆 黎

（首都医科大学公共卫生学院，北京100069）

核转录因子E2相关因子2和Keap1的分子结构和功能及其信号通路调控分子机制研究进展

王朝阳，荆 黎

（首都医科大学公共卫生学院，北京100069）

核转录因子E2相关因子（Nrf2）和抗氧化反应元件（ARE）结合可启动多种抗氧化、抗炎蛋白和解毒酶的表达。Nrf2/ARE信号通路在机体抗氧化和抗外源有毒化学物损伤过程中发挥着重要的作用，不仅参与调节营养物质代谢等生理过程，也参与多种疾病的发病过程。本文综述了Nrf2/ARE的生物学结构和功能及其信号通路调控的分子机制。

核转录因子E2相关因子；氧化应激；抗氧化反应元件；调控机制

核转录因子E2相关因子2（nuclear factor ery⁃throid 2 related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路是调控细胞内氧化应激水平的核心通路，直接影响细胞内的氧化应激水平，因而与多种疾病的发生密切相关［1-2］。该信号通路可调控多种靶基因的表达，如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、DNA修复酶、分子伴侣蛋白和抗炎蛋白等多种与氧化应激和化学应激相关的蛋白编码基因，占人类基因总数的1%～10%［3-4］。Nrf2/ARE信号通路本身也受到机体的严密调控，该调控网络的异常会导致多种疾病的发生。本文综述其研究进展，以阐明Nrf2/ARE信号通路调控的分子机制。

1 Nrf2的结构和功能

Nrf2分子质量为66 ku，具有碱性亮氨酸拉链结构（basic leucine zipper，bZIP），是CNC（cap‘n’collar）转录因子家族中的重要成员，且转录活性最强［2］。1994年，Moi等［5］首先发现并克隆出Nrf2蛋白，由于Nrf2蛋白可结合到转录因子AP-1和NF-E2结合的共有序列上，故得名。除Nrf2外，CNC家族还包括P53，P45，Nrf1，Nrf3，Bach1和 Bach2［6-7］。Nrf2蛋白广泛表达于肝、肾、心、肺、神经组织、消化道上皮等多种组织细胞，由7个结构域组成，分别为Neh 1～Neh 7［8］。Neh1包含1个CNC-bZIP结构，该结构可与Maf蛋白结合形成异二聚体并与DNA上的ARE结合［9］。Neh2包含DLG和ETGE模体（motif），可招募Kelch样环氧氯丙烷（ECH）相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）［10］，从而负调控Nrf2的转录活性。Neh2突变可使Nrf2失去与Keap1的结合能力，导致Nrf2的持续活化［11］。Nrf2羧基端的Neh3可招募色素-ATP酶/螺旋酶DNA结合蛋白6，是Nrf2的反式激活结构域［12］。Neh4和Neh5也是Nrf2的反式激活结构域。Nrf2与Maf蛋白结合形成的二聚体即使与ARE结合也不能独立地激活靶基因的转录，尚需通过Neh4和Neh5与其他转录辅助因子（如CREB结合蛋白、受体相关辅助激活因子）结合才能启动靶基因的转录［13］。Neh6包含DSGIS和DSAPGS模体，可借助DSGIS和DSAPGS与二聚体β转导子重复包含蛋白结合从而负调控Nrf2的转录活性［14-16］。Neh7介导Nrf2与视黄酸X受体的物理性结合，这种结合可抑制Nrf2的转录活性［17］。

2 Keap1的结构与功能

Keap1因与果蝇肌动蛋白结合蛋白Kelch相似而得名［18］。是位于细胞质中的Nrf2的负调控蛋白，可与Nrf2和细胞骨架蛋白（肌动蛋白）结合，将Nrf2定位于细胞质而无法进入细胞核发挥其转录活性。Keap1包含624个氨基酸残基，具有5个结构域：NTR，BTB，IVR，DGR和CTR［8］。DGR可与Nrf2的Neh1结合，也可与肌动蛋白结合［19］。BTB可介导Keap1形成同二聚体，BTB的第104位氨基酸高度保守，该氨基酸的突变可使Keap1无法形成二聚体。IVR结构域富含半胱氨酸，是氧化剂和亲电子剂的感受区。当细胞内氧化水平异常升高或细胞暴露于亲电子剂时，IVR结构域的半胱氨酸残基（Cys226，Cys273和Cys288）可与氧化剂或亲电子剂反应，导致Keap1构象的改变，与Nrf2分离，后者则进入细胞核内，启动抗氧化基因或解毒酶基因的转录。除了IVR结构域具有氧化剂和亲电子剂感受性外，BTB结构域的Cys151，DGR结构域的Cys434和CTR结构域的Cys613也可感受细胞内的氧化应激水平［20-24］。例如，当暴露于气态递质（gasotransmitter）硫化氢时，Cys226可与Cys613形成二硫键，从而使Keap1构象发生改变［25］。

3 Nrf2活性调控的分子机制

3.1 蛋白质水平的活性调控

目前，多数观点认为细胞对Nrf2活性的调控主要发生在蛋白质稳定性水平。细胞在基础状态下即有足量Nrf2表达，此时大部分Nrf2被Keap1介导的泛素化降解途径所降解；氧化应激时，Keap1构象改变，失去对Nrf2的降解作用，Nrf2由细胞质进入细胞核，发挥转录活性。此外，氧化应激和化学应激也可激活某些蛋白激酶，使Nrf2发生磷酸化而活化。

3.1.1 Keap1抑制Nrf2活性

Keap1是Nrf2活性调节的分子开关。生理状态下，Keap1可通过C端的Kelch重复结构域与Nrf2 N端的Neh2结构域结合，将Nrf2锚定在微丝上，并可介导Nrf2的泛素化降解。Keap1的N端具有BTB结构域，与其他具有BTB结构域的蛋白一样是滞蛋白（cullin）依赖性泛素连接酶E3的作用底物，可介导Nrf2的泛素化，并最终为26S蛋白酶体所降解。这个过程中Keap1起了连接Nrf2和Cul3-Rbx1-E3泛素连接酶复合体的作用［26］。综上，生理状态下Keap1通过将Nrf2锚定在细胞质中及介导Nrf2的泛素化降解抑制Nrf2活性的。

当细胞内氧化物或自由基增多时，或细胞暴露于亲电子物质时，Keap1上的敏感氨基酸残基（主要是半胱氨酸残基）可与氧化剂、自由基或亲电子剂反应，进而导致Keap1构象改变，失去与Nrf2的结合能力，后者则可游离并在Nrf2的Neh1结构域核转位信号的指导下由胞质进入胞核，在细胞核内不断蓄积并启动靶基因的转录。

关于Keap1和Nrf2的相互作用，目前提出了一个“铰链与门闩”或两位点底物识别的模型（hinge and latch或two-site substrate recognition model）［27］。该模型认为Keap1同二聚体的Kelch结构域可与Nrf2的Neh2结构域N端的DLG模体和ETGE模体结合。Keap1与DLG的结合是弱结合（门闩），与ETGE的结合是强结合（铰链），铰链的强度是门闩的100倍［28］。每2个Keap1可结合1个Nrf2上的DLG和ETGE模体，这种结合可使位于这两种模体之间的可接受泛素的7个氨基酸残基排列成合适的构象，以利于泛素的连接［29］。当处于氧化或化学应激时，Keap1上的敏感氨基酸残基发生反应，导致Keap1构象改变，破坏了Kelch与DLG的弱结合（门闩破坏），但是Kelch与ETGE的强结合不受影响（铰链保留）。此时，Nrf2依然与Keap1结合，但是Nrf2的泛素化明显减弱，结果导致Keap1被Nrf2饱和，新生成的Nrf2不断地自胞质进入胞核，启动靶基因的转录。值得注意的是，当Nrf2表达增加时，Nrf2本身可诱导Keap1的表达。显然这是Nrf2的一种负反馈调节机制，可能会防止Nrf2/ARE通路的过度活化或者有利于该通路的及时终止。

3.1.2 蛋白激酶激活Nrf2的活性

除了Keap1，多种蛋白激酶对Nrf2的磷酸化也可实现对Nrf2活性的快速调节。有研究指出，当细胞内ROS产生时可激活某些蛋白激酶，后者可直接作用于Nrf2，促使其发生磷酸化修饰和构象改变，进而与Keap1分离，进入细胞核内发挥转录活性。一种典型的使Nrf2发生磷酸化激活的物质是冈田酸，它是一种高效的蛋白磷酸酶抑制剂，可高效地促使细胞内蛋白质发生磷酸化。冈田酸处理HepG2细胞能促进Nrf2的核蓄积和含ARE转基因的转录［30］。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、细胞外信号调节激酶、PKR样内质网激酶、PI3K和MAPK等均可使Nrf2发生磷酸化激活。目前研究比较清楚的是PKC可使位于Nrf2的Neh2结构域上的Ser40发生磷酸化，导致Nrf2与Keap1的解离［31］。已经证明Ser40是PKC的作用靶点，因为用Ala40置换Ser40后，PKC对Nrf2的激活作用明显减弱［32］。但如以Glu40代替Ser40，即使没有PKC，也会出现Nrf2磷酸化的系列表现，Nrf2在细胞核内大量蓄积［33］。但并非所有的蛋白激酶对于Nrf2的磷酸化都是产生激活效应的，这可能与磷酸化位点的不同有关。酪氨酸蛋白激酶Fyn可使Nrf2的Tyr568发生磷酸化，进而促使Nrf2从细胞核移出［34］。因此，不同蛋白激酶对Nrf2不同位点氨基酸残基的磷酸化修饰可能导致Nrf2的激活或抑制，充当了Nrf2活性的分子开关。值得指出的是，各种蛋白激酶对Nrf2活性的调节只是一种“微调”，因为当敲除Keap1基因或使用siRNA技术沉默Keap1时，Nrf2和下游靶基因处于持续的活化状态，此时蛋白激酶诱导剂刺激Nrf2活化的作用并不能显现出来。这说明Keap1对Nrf2活性的调节可能是一种最为重要的总体调节，而蛋白激酶对Nrf2活性的调节可能只是一种精细的微调［35］。

3.1.3 其他蛋白质因子对Nrf2活性的调控

细胞对Nrf2活性调节最主要的方式是Keap1的抑制和蛋白激酶的活化作用，此外还有许多蛋白因子可影响Nrf2的活性。Bach1与Nrf2一样也属于CNC-bZIP转录因子家族，广泛表达于各种组织细胞。Bach1也可与Maf蛋白结合，Bach1-Maf蛋白复合物也可识别并结合ARE，但却不能启动ARE下游基因的转录，从而竞争性地抑制Nrf2与Maf蛋白的结合及Nrf2-Maf复合物与ARE结合，最终抑制ARE靶基因的转录。当细胞处于氧化应激状态时，Bach1基于某种未知的机制，与Maf蛋白解离并移出胞核降解。此时Nrf2与Keap1解离，移入胞核，并与Maf蛋白形成复合物，与靶基因上游的ARE结合启动靶基因的转录。现在已经知道，Bach1可与Nrf2靶基因之一的血红素加氧酶1基因的ARE结合，抑制人类和小鼠的血红素加氧酶1基因转录［36］。还有研究指出Nrf2对血红素加氧酶1的转录启动作用是以Bach1的出核降解为前提的［37］。当进入细胞核内的Nrf2增多时，可诱导Bach1的重新合成和入核，进而抑制Nrf2的活性［36］。显然，Nrf2的这种负反馈调节作用有利于Nrf2/ARE信号通路的及时终止和避免Nrf2活性的剧烈波动。Chen等［38］发现P21蛋白可通过其KRR模体直接与Nrf2的DLG模体和ETGE模体相互作用，增加Nrf2蛋白的稳定性；由于可与Keap1竞争性地结合Nrf2，因而还可减少Keap1介导的Nrf2泛素化降解。事实上，细胞内还具有许多蛋白质因子（P62/SQSTM1，二肽基肽酶3/DPP3等）可通过竞争性地结合Keap1而使Nrf2活化，这可能是基础状态下Nrf2/ARE信号通路仍然具有部分活性的原因。

3.2 Nrf2活性调控的表观遗传学机制

Nrf2活性调控主要发生在蛋白质水平，但是近年来发现Nrf2的表观遗传学调控也可能具有重要意义。尽管Nrf2广泛表达于多种组织细胞，但不同类型细胞的Nrf2 mRNA表达水平却相差很大［39］，造成这种差异的原因尚不清楚。但在前列腺肿瘤发生过程中，发现Nrf2的表达量显著降低，这是因为在Nrf2的启动子区域具有5个CpG序列，这些CpG序列发生了高度的甲基化［40］。由此可推测，不同类型正常细胞的Nrf2表达差异也可能与表观遗传学调控有关。目前关于Nrf2表观遗传学调控的研究并不多，这里主要介绍Nrf2启动子多态性和miRNA对Nrf2表达水平的调节及机制。

3.2.1 Nrf2启动子多态性对Nrf2表达的影响

研究发现，小鼠Nrf2基因启动子区域的单核苷酸多态性可影响Nrf2基因的表达，该多态性位点位于转录起始点上游-336 bp的位置，与不同品系小鼠对急性肺损伤的易感性差异有关［41］。值得注意的是，在人类NRF2基因启动子区域也发现了一个单核苷酸多态性调控Nrf2表达的例子，该单核苷酸多态性位于一个ARE样序列（rs6721961）中，与人Nrf2表达量降低和对肺损伤易感性增加有关［42］。

3.2.2 miRNA对Nrf2表达的调控

miRNA可抑制Nrf2 mRNA的翻译过程，这是因为这些miRNA可与Nrf2 mRNA的3′非翻译区互补配对，降低Nrf2 mRNA的稳定性并阻遏其翻译过程。迄今，所有miRNA对Nrf2表达水平影响的实验都是体外人为增加某种miRNA的表达水平，观察到Nrf2 mRNA和蛋白表达量降低。但在自然状态下，miRNA对Nrf2表达水平是否有影响，以及这种调控作用在所有Nrf2活性调控机制中的相对重要性仍有待进一步研究。细胞实验证实，在人MCF-7乳腺癌细胞中异位表达miR-28可以降低Nrf2 mRNA和蛋白的表达量［43］；在人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中过表达miR-27a，miRNA-142-5p，miRNA-144及miR-153也可降低Nrf2 mRNA和蛋白的表达量［44］；同样，在人MCF-10A和T47D乳腺癌细胞中过表达miR-93，可降低Nrf2 mRNA和蛋白的表达［45］。目前关于lncRNA对Nrf2表达水平调控的研究很少，但是与miRNA类似，lncRNA很可能也参与了Nrf2活性的表观遗传学调控，因而需要更深入的探索和研究。

总的来看，Nrf2活性的表观遗传学调控可能是一种对Nrf2活性的长期调控或基础调控，对外界环境因子的敏感性和反应性可能不及Keap1或蛋白激酶。Keap1和蛋白激酶对Nrf2活性的调控是一种直接、迅速、即时的调控，对于细胞应对氧化应激和化学应激可能更为重要。

3.3 小分子化学物对Nrf2活性的调控

Nrf2/ARE信号通路与多种疾病密切相关，是很有前景的药物作用靶点。目前已有许多可调节Nrf2活性的天然和人工合成化学物。它们可分为Nrf2活性激活剂和抑制剂2类。值得指出的是，这些小分子化学物对Nrf2活性的调节多是间接性和激活性的。今后需要加大直接调节Nrf2活性和抑制Nrf2活性小分子化学物的研究，因为已有研究表明，Nrf2过度活化与肿瘤细胞的耐药性有关，利用Nrf2的抑制剂可增加肿瘤细胞对药物的敏感性。抗坏血酸是一种高效的抗氧化剂，可降低细胞内过氧化物水平，最终抑制Nrf2与GCL基因启动子区域的ARE结合。用抗坏血酸处理具有伊马替尼抗性的细胞系KCL22/SR导致细胞谷胱甘肽水平降低和对伊马替尼敏感性的增强。KCL22/SR细胞对伊马替尼敏感性的增强至少部分是由于抗坏血酸对Nrf2活性的抑制［46］，但抗坏血酸对Nrf2活性的抑制显然是一种间接依赖Keap1的方式。Wang等［47］发现全反式视黄酸可显著抑制Nrf2的活性，其机制是在全反式视黄酸的存在下，Nrf2可与视黄酸受体α形成Nrf2-视黄酸受体α复合体，因而无法与靶基因启动子区域的ARE结合。最近Olayanju等［48］发现一种苦木苦味素化合物鸦胆子苦醇（brusatol）能迅速和一过性地降低Nrf2蛋白质水平，且证明这种抑制是发生在Nrf2转录后水平（即只有Nrf2蛋白表达降低，而Nrf2 mRNA表达并未下降），是Keap1、蛋白激酶等非依赖性的，但是鸦胆子苦醇导致Nrf2蛋白表达降低的具体机制尚不清楚。木犀草素（lute⁃olin）是一种黄酮类植物化学物，可以氧化-还原非依赖性方式抑制ARE基因的表达［49］。已知非小细胞性肺癌A549中Nrf2组成型活化，木犀草素处理细胞后能显著降低Nrf2的mRNA和蛋白质水平，致使Nrf2无法入核与ARE结合，进而下调ARE基因的表达。木犀草素的这种作用可能与其加速Nrf2 mRNA的降解有关。但是，Lin等［50］却在PC12细胞中得出了完全相反的结论，在PC12细胞中木犀草素能促进血红素加氧酶-1 mRNA和蛋白质的表达，抑制细胞凋亡，增加Nrf2与ARE的结合。事实上，目前对抑制Nrf2活性的小分子化学物的研究很少且争议颇多。今后需加强这方面的研究，如通过高通量筛选和基于结构的药物设计等方法开发安全、高效、可逆的Nrf2小分子抑制剂，以便于实验室和临床上的应用。

4 Nrf2/ARE信号通路调控的靶基因

4.1 抗氧化蛋白/酶类基因

Nrf2/ARE信号通路是氧化应激时机体激活的最主要的通路，可激活许多抗氧化蛋白/酶类的表达。抗氧化蛋白/酶类可有效代谢各种自由基、ROS及其他过氧化物，避免过氧化物对细胞的损伤，有利于细胞在氧化应激状态下的存活。现已证明，Nrf2/ARE通路激活的抗氧化酶类有血红素加氧酶1、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽还原酶2和4和依赖还原型辅酶Ⅱ/醌氧还蛋白1等，这些酶类都具有抗氧化功能，能减少过氧化物的产生或加速过氧化物、自由基的清除。Nrf2/ARE通路激活的抗氧化蛋白很多，主要包括过氧化氧还蛋白1和6、巯基氧还蛋白1、硫氧还蛋白（thioredoxin）和谷胱甘肽等。它们对于清除自由基、避免生物大分子氧化损伤具有重要意义［8］。

4.2 解毒酶类基因

Nrf2/ARE信号通路也是化学应激时机体激活的主要通路，可以激活许多代谢、转运、排泄有毒化学物的蛋白和酶类，有利于细胞在化学应激状态下的存活。Nrf2促进转录的解毒酶类包含了Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ相解毒酶［8］，Ⅰ相解毒酶主要是催化外源化学物的氧化、还原和水解反应，可以直接破坏毒物的结构，降低毒性。Ⅱ相解毒酶主要催化外源化学物或外源化学物经Ⅰ相解毒酶代谢的中间产物的结合反应，增加化学物的水溶性，促进其排出体外。Ⅲ相解毒实质上是细胞将细胞内的外源化学物泵出细胞的过程，主要由一些依赖ATP的主动转运蛋白承担。

5 结语

Nrf2/ARE信号通路是机体应对氧化应激和化学应激的主要通路，参与细胞增殖、三大营养物质代谢、细胞凋亡和衰老等多种生物学过程，与肿瘤、心血管疾病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、肝肾疾病和炎症等多种疾病的发生密切相关。该通路主要受胞浆蛋白Keap1和各种蛋白激酶信号通路的调控，而表观遗传学调控也具有一定的意义，这方面的研究较少，需要进一步的探索。Nrf2活化的靶基因绝大多数都是细胞保护基因，可促进细胞存活，避免细胞受到损害，因而是很有前景的药物作用靶点。

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Research progress in molecular structure and function of nuclear factor erythroid 2 related factor 2 and Keap1 and regulation mechanism of signalpathways

WANG Zhao-yang，JING Li
（Schoolof Public Health，CapitalMedica lUniversity，Beijing 100069，China）

The binding of the nuclear factor erythroid 2 related factor 2（Nrf2）to the antioxidant response elements（ARE）can start the expression of batches of antioxidant proteins，anti-inflammatory factors and detoxification enzymes.Nrf2/ARE signalling plays a pivotalrole in anti-inflammation and in preventing xenobiotics induced lesions.Besides involvenment in physiological processes，such as regulating nutrient metabolism，Nrf2/ARE signalling also functions in the pathogenesis ofvarious dieases. This review outlines the strcuture，functions，and regulation of Nrf2/ARE signalpathways.

nuclear factor erythroid 2 related factor 2；oxidative sress；antioxidantresponse ele⁃ment；regulation mechanism

The projectsupported by NationalNaturalScience Foundation of China（81202608）

JING Li，E-mail：jingli12@163.com

R963

A

1000-3002-（2016）05-0598-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.018

2015-09-07接受日期：2015-11-12）

（本文编辑：齐春会）

国家自然科学基金项目（81202608）

王朝阳，硕士研究生，Tel：18811625182，E-mail：18611000168@163.com

荆黎，Tel：15810500163，E-mail：Jingli12@ 163.com