张力刺激对经脉筋膜成纤维细胞整合素β1亚基影响的体外研究*

★　熊江艳　陈波*　刘峰,3　胡铁汉　(.贵阳中医学院第一附属医院　贵阳 55000；.贵阳中医学院针灸推拿学院　贵阳 55005；3.九江学院附属医院急诊科　江西 九江 33000)

*基金项目：国家自然科学基金项目(81160456)；贵州省科技基金项目(黔科合J字[2014]2030号)。

**第一作者：熊江艳(1982—)，女，硕士。研究方向：针灸推拿的基础与护理运用。



张力刺激对经脉筋膜成纤维细胞整合素β1亚基影响的体外研究*

★熊江艳1**陈波2***刘峰2,3胡铁汉2(1.贵阳中医学院第一附属医院贵阳 550002；2.贵阳中医学院针灸推拿学院贵阳 550025；3.九江学院附属医院急诊科江西 九江 331000)

*基金项目：国家自然科学基金项目(81160456)；贵州省科技基金项目(黔科合J字[2014]2030号)。

**第一作者：熊江艳(1982—)，女，硕士。研究方向：针灸推拿的基础与护理运用。

摘要：目的：探讨体外张力刺激对来自经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞的整合素β1亚基的影响，从实验和理论的角度佐证针推基本机械力学感受的基本原理。方法：应用不同强度的张力对培养的经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞施加单次和多次刺激，成纤维细胞整合素β1表达情况通过荧光显微镜技术和图像分析技术进行观测。结果：跟空白对照组相比，在不同的刺激强度因素和刺激次数情况下，经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1荧光密度表达均增高，有统计学意义(P=0.000<0.01)。结论：在张力刺激作用下，经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1表达量发生了改变，在微观力学上可能揭示针推张力刺激在经脉组织细胞中信号感受的细胞生物学机制。

关键词：张力刺激；经脉；筋膜；成纤维细胞；整合素β1

针灸推拿是临床护理常用的治疗手段之一，而针灸推拿操作过程中存在大量的生物力学现象[1]。笔者课题组前期的研究表明：经脉腧穴来源的筋膜结缔组织成纤维细胞受压力刺激作用后，胞膜上力感受器分子中几种整合素(Integrins)亚基的表达分布和含量均发生变化，这证实了整合素确是经脉非神经组织细胞感受针推治疗信息的重要物质基础[2]。而经脉相关筋膜成纤维细胞如何感受张力刺激目前尚不清楚。因此，本课题一方面选择张力为研究对象，另一方面载体的选择上继续选择同经脉腧穴相关筋膜成纤维细胞，在研究载体上独立施加不同强度的张力，观察经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1表达变化情况，深入探讨体外张力刺激对经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞力学信号生物感传通路的影响，为针推机械力刺激的细胞生物学作用原理提供实验依据，现将研究结果报告如下。

1材料和方法

1.1主要试剂兔抗鼠整合素β1多克隆一抗(USA，Santa Cruz Crop；批号：SC-8978)、抗荧光淬灭封片液(江苏，碧云天生物技术研究所；批号：P0126)、FITC标记的羊抗兔二抗(KPL；批号：N1230010)、标准型胎牛血清(FCS，Hyclone，100mL；批号：BUC175)、低糖DMEM培养基(Gibco，USA，500mL；批号：NUH0187)、Ⅰ型胶原酶(Sigma，USA，100mg；批号：TA0512)、胰蛋白酶(Gibco，USA，10g；批号：MA446)、新生小牛血清(批号：090428；100mL，哈里生物工程有限公司)、封闭用正常山羊血清原液(北京，中杉金桥；批号：111106)。

1.2主要实验器材CO2恒温培养箱(MCO-15AC型，SANYO，Japan)、荧光显微镜及组像系统(Olympus，1×71，Japan)、成都电子科技大学提供的四点弯曲力学加载装置、HHWCu600型电热恒温水浴箱(上海医疗器械厂)、细胞培养瓶(美国Costar公司)。

1.3经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞的原代、传代培养将SD孕鼠(四川大学华西医学院动物中心提供，动物证号：SCXK(111)2009-09，孕期14天)颈椎脱臼处死，用手术剪剪开腹腔，将子宫剪下，在超净台上，用眼科剪和镊子，将子宫剪开，取出胎鼠，置于解剖显微镜下，取胎鼠背部正中线督脉及其附近皮肤及皮下组织，宽约4mm，用手术刀刮取皮下筋膜结缔组织，置于培养皿中，加3mL0.1%Ⅰ型胶原酶,用眼科剪将组织剪成糊状，置于水浴摇床中消化30min；按成纤维细胞常规体外实验方法提取、培养和传代扩增细胞量。

1.4经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞张力加载实验

1.4.1加力板准备将四点弯曲细胞应变片置于浓硫酸中，隔夜后用清水冲洗，然后三蒸水重复冲洗数遍，在75%乙醇中浸泡24h，去除油脂成分；在无菌、超净环境下，经过紫外线照射杀菌，接种细胞。

1.4.2细胞种板操作步骤取第5-8代的经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞，制细胞悬浮液，按细胞密度1×104/mL接种于四点弯曲细胞应变片上，1mL/片，2～4h后在培养皿中加入无血清的DMEM20mL持续培养24h，细胞同步化后，换20mL 10%FCS的DMEM。

1.4.3实验设计与分组(1)分组：将细胞随机分为空白对照组，低、中、高强度张力刺激组，单次加力组和多次加力组。(2)张力刺激组处理：将张力刺激组细胞置于四点弯曲力学加载装置，然后移入100%湿度、5%CO2、37℃培养箱中，分别将四点弯曲力学加载装置位移调节至0.5mm(1000μstrain，低强度张力刺激)、1mm(2000μstrain，中强度张力刺激)和1.5mm(3000μstrain，高强度张力刺激)，0.5Hz频率单次加力，2h/次；多次加力时间间隔24h，取出细胞备检时间为加力结束后再继续培养2h。(3)空白对照组处理：将空白对照组置于100%湿度、5%CO2、37℃培养箱中正常培养，不作任何处理，取出备检时间与各张力组一致。

1.5整合素β1表达检测(免疫荧光技术)移弃培养基，PBS清洗5min/次，3次；加入40g/L的多聚甲醛2mL毫升，固定30min，PBS洗3次，5min/次；加0.5%TritonX-100置20min，PBS清洗3次，5min/次；避光加3%H2O2去离子水20min，PBS清洗3次，5min/次；加5%正常山羊血清封闭液30min；加1∶100兔抗鼠整合素β1多克隆一抗4℃过夜后，复温30min，PBS避光清洗3次，5min/次；避光加1∶20FITC标记的羊抗兔二抗30min，PBS避光洗3次，5min/次；避光在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片液，血盖片细胞面向下置于载玻片上封片避光送检，荧光显微镜下采图。然后，采用Image Pro Plus图像定量分析软件，扫描加力板上显色成纤维细胞进行染色积分光密度定量测量。

图1　空白对照组荧光密度(单次加力，×400)　　　　　图2　低强度张力刺激组荧光密度(单次加力，×400)

注：析因方差分析表明,刺激强度因素MS=7.705，F=12773.860，P=0.000<0.01；刺激次数因素MS=0.259，F=429.876，P=0.000<0.01；刺激强度与刺激次数综合因素MS=14.712，F=24389.833，P=0.000<0.01。

2结果

从图1-8、表1可以看出：①单次刺激各组中以3000μstrain组的荧光密度最大，空白对照组的荧光密度最小；②多次刺激各组中荧光密度最大出现在2000μstrain组，荧光密度最小出现在3000μstrain组；③本次实验荧光密度最大组是2000μstrain多次刺激组；④实验组与空白对照组对比，不同的张力刺激强度因素与不同的刺激次数因素对经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1荧光密度表达增高有显著统计差异(P=0.000)；⑤张力刺激次数和刺激强度两因素累加对经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1荧光密度的提高有统计学意义(P=0.000)。

3讨论

从毫针针刺力学理论分析[1]，当毫针刺入腧穴后，如捻转达到一定幅度，在不直接接触针体的邻近区域，穴区组织细胞会受到缠绕针身的细胞基质传导的、沿针体转动切线方向的牵张力作用；行针是以摆动为主要操作的，针体对周边组织也会产生与针体摆动方向相反的牵张力刺激。从推拿按摩手法的力学维向分类[3]，不同手法又可分为一维力型手法、二维力型手法、三维力型手法，因此，推拿按摩的力学刺激中张力作用也是重要的力学形式之一。

现代研究表明：筋膜结缔组织是经络腧穴的物质基础[4]，除了神经生物学机制[5]，针灸推拿发挥治疗作用还存在非神经生物学机制[6]。在非神经生物学机制中，整合素是力学信息生物转换的重要力感受器分子之一——整合素是一个膜受体家族[7]，α、β两条链以非共价键连接而成的异源双体构成成员分子。α、β两条链都具有胞内区、胞外区和跨膜区，β链膜内与细胞骨架相连，β链胞外区与胞外基质相连，似一座桥梁介导细胞内外信息的传递。由于组成亚基不同，整合素主要分为β1、β2、β3等3类，功能有所差异。其中，整合素β1亚基与整合素α1-8和αv亚基可分别组成整合素VLA-1-6、α7β1、α8β1及αvβ1(VNR)共12种整合素，在各种细胞中广泛表达。当力学刺激作用于组织或细胞后，Integrins在细胞膜上衔接集聚，Integrin细胞外区域直接与ECM蛋白结合，而胞浆内的区域则与细胞内的细胞骨架(主要是微丝)和信号复合体结合，共同形成局部黏附，激活局部黏附激酶通道，引起细胞核内基因表达的变化[8]。Ingber[9-10]等发现扭力对细胞表面的作用，可以激发cAMP的信号级联反应和后续基因表达，该过程被认为是由Integrinβ1的变形传递至微丝激发所致，因此，目前认为力的感传方式中Integrins途径是最主要的途径之一。

本次研究显示：经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1可以感受不同程度的张力刺激：单次刺激，在重度刺激强度下经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1表达量高；多次刺激，在中度刺激强度下经脉相关筋膜结缔组织成纤维细胞整合素β1表达量高。这表明针灸推拿学的临床意义可能是：张力是经络腧穴的有效刺激手段，在采用针灸推拿进行临床护理时，短时间周期或单次的治疗，以能产生张力刺激较重手法为首选；长时间周期或多次治疗，以能产生张力刺激较轻的手法为首选，它可使经穴组织细胞的感受能力保持在较高水平。但这需要在体研究的进一步验证。

参考文献

[1]陈波,江瑜,张小珊,等.机体非神经组织力学敏感细胞的研究与针推治疗作用机理的新思考[J].贵阳中医学院学报,2012,34(1):9-12.

[2]吴小凤,王兴桂,刘峰,等.基本机械力学刺激对腧穴筋膜成纤维细胞力感受器分子整合素α2、αv亚基表达影响研究[A].2012全国腧穴应用与研究暨针灸教育研讨会论文集,2012：45-48.

[3]陈波,王兴桂,李小玉,等.体外压力刺激对大鼠“足三里”穴筋膜组织细胞合成释放肿瘤坏死因子-α和干扰素-β影响的研究[J].时珍国医国药,2011,22(3):734-736.

[4]费伦,承焕生,蔡德亨,等.经络物质基础及其功能性特征的实验探索和研究展望[J].科学通报,1998,43(6):658-672.

[5]郭义.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2008:416.

[6]陈波,崔瑾,谢西梅,等.体外压力刺激对大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞合成释放基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶抑制剂1、前列腺素E2和胰岛素样生长因子1的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,15(15):2 756-2 759.

[7]Viola V, Wendy GT, David WC. Structural insights into the mechanical regulation of molecular recognition sites[J].Trends in Biotechnology,2001,19(10):416.

[8]Bloom S,Lockarcl VC,Bloom M.Intermediate filament-mediated stretch-induced changes in chromatin: a hypothesis for growth initiation in cardiacmyocyte [J].J Mol Cell Cardiol,1996,28(10):2 123-2 127.

[9]Ingber DE.Tensegrity:the architectural basis of cellular mechanotransduction[J].Annu Rev Physiol,1997,59(1):575-599.

[10]Alenghat FJ,Tsai KY,Goldmann WH, et al.Analysis of cell mechanics in single vinculin-deficient cells using a magnetic tweezer[J].Biochemical and Biophysical Research Communication,2000,277(1): 93-99.

收稿日期：(2015-07-08)编辑：万崇毅

中图分类号：R245.2

文献标识码：A

通信作者：***陈波(1974—)，男，博士，教授，硕士生导师。研究方向：针灸推拿的基础与临床运用。E-mail:chenbomed@163.com。