EZp基因在结直肠癌肿瘤干细胞化疗中的临床意义及耐药作用

王　晶　刘新秀　刘　涛　吴晶晶　瞿　娇　李品东

(华中科技大学国济医学院附属协和医院肿瘤科，湖北　武汉　430030)



EZp基因在结直肠癌肿瘤干细胞化疗中的临床意义及耐药作用

王晶刘新秀刘涛吴晶晶瞿娇李品东

(华中科技大学国济医学院附属协和医院肿瘤科，湖北武汉430030)

〔摘要〕目的探讨EZp基因与结直肠癌各临床病理参数、生存期的关系以及在结直肠癌细胞耐药模型LoVo/5-Fu中的表达情况。方法采用SP免疫组化技术检测结直肠癌中EZp的表达情况，利用SPSS19.0软件分析EZp的表达与结直肠癌临床参数、生存期的关系；用半定量RT-PCR方法对EZp基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证。结果EZp表达与Dukes分期、淋巴结转移情况相关(P<0.05)；EZp阳性组中位生存时间为43个月，阴性组中位时间>48.74个月，两组生存函数经Log-Rank检验有统计学差异(χ2=5.86，P=0.015)；EZH2在LoVo/5-Fu与LoVo中的表达有差异。结论EZH2基因可能与LoVo/5-Fu细胞株耐药机制有关，提示EZH2基因表达可能影响癌细胞对5-Fu敏感性；且EZH2基因对判断结直肠肿瘤转移机制以及病情进展有一定临床价值。

〔关键词〕EZH2；结直肠癌；肿瘤干细胞；耐药性

第一作者：王晶(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事肿瘤研究。

EZp(果蝇E(z)基因的同源基因)是新人类基因，属PCG(Ploycomb Group)家族基因〔1〕，与细胞生长调节有关，通过抑制染色质中靶基因促进细胞增殖。EZp蛋白为转录抑制因子，可抑制多种基因活性如抑制肿瘤转移抑制基因，EZp蛋白可促进肿瘤细胞的转移与侵袭〔2〕。有相关报道表明EZp在多种肿瘤中已有所表达〔3〕，但关于结直肠癌的报道少见。本实验拟观察EZp基因与结直肠肿瘤转移及病情进展的关系。

1材料与方法

1.1材料56例结直肠癌组织标本，均取自我院2008年3月至2011年3月普外科结直肠癌手术的结直肠癌组织标本。纳入标准：①原发肿瘤；②手术前未予以化疗及放疗等治疗。排除标准：非原发肿瘤、接受化疗及放疗等治疗。男30例，女26例；年龄38～80岁，平均61.32岁。根据EZp在结直肠癌组织中的表达，将病例分为阳性和阴性2组进行比较。本研究末次随访时间为2014年3月13日，随访最长时限61个月。

1.2方法

1.2.1SP免疫组化方法检测组织中EZp的表达所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，3 μm厚连续切片。石蜡切片常规脱蜡，PBS液冲洗，EZp采用S-P法免疫组化染色，所用抗体浓度为EZp 1∶300。以PBS溶液代替一抗做空白对照，以排除假阳性结果。

1.2.2免疫组化结果观察按肿瘤细胞阳性率分析结果。在(200、400倍)显微镜下观察，每张切片随机选取3～4个高倍视野。因EZp蛋白定位于细胞核，阳性反应为位于细胞核内的棕黄色颗粒，中等以上染色，且超过10%的肿瘤细胞有阳性染色者判为阳性表达，否则为阴性表达。

1.2.3细胞培养及耐药细胞系的建立结直肠癌LoVo细胞在37℃，50 ml/L CO2，饱和湿度的培养箱中培养，培养液为含100 ml/L热灭活小牛血清，青霉素100 kU/L和链霉素100 mg/L的RPMI1640培养液。采用药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)持续接触浓度递增诱导法建立人结肠癌耐药细胞系LoVo/5-Fu，可在含5-Fu 浓度为5.0～6.0 mg/L的培养液中稳定生长。

1.2.4半定量RT-PCR采用TRIzol一步法提取LoVo和LoVo/5-Fu细胞的RNA；以1 μg 总RNA进行逆转录合成cDNA，分别进行不同循环数的PCR循环，以确定最佳扩增循环数(26～28个)，并进行温度梯度PCR，以确定各对引物的最佳退火温度。β-actin作为内参，EZp上游引物：5′-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3′，下游引物：5′-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA-3′；β-actin上游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。以β-actin mRNA水平作为内参照，每个PCR产物取10 μl在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用Alpha Innotech的凝胶成像系统(FluorChem IS-9900)，Alpha Ease FC软件对电泳条带进行分析。

1.3统计学分析采用SPSS19.0软件行χ2检验。生存曲线的构建采用Kaplan-Meier方法，行Log-Rank检验。

2结果

2．1结直肠癌组织中EZp的表达与临床病理参数的关系EZp基因在结直肠癌组织标本中的阳性率与病变部位、病理分型、分化程度、肿瘤大小无关(P>0.05)，与Dukes分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

2.2EZp表达与生存期的关系EZp阳性组共33例，其中7例存活，26例死亡。阴性组共23例，其中15例存活，8例死亡。阳性组中位生存时间为43个月，阴性组中位时间>48.74个月。两组生存函数经Log-Rank检验，差异有统计学意义(χ2=5.86，P=0.015<0.05)。

2.3EZH2基因验证运用半定量RT-PCR方法检测LoVo和LoVo/5-Fu细胞中EZH2基因在转录水平的差异表达，结果显示，耐药细胞中EZH2mRNA表达有所上调,见图1。

表1　结直肠癌组织中EZp表达与

图1　LoVo和LoVo/5-FU细胞中EZp基因在转录水平的表达

3讨论

近年来，结直肠癌发病率逐年上升，严重威胁人类健康〔4，5〕。基因在许多疾病发生发展中起重要作用，认为可能是疾病致病因素，目前有关基因治疗这一研究方向得到相关学者重视〔6〕。APC-B-catenim-Tcf-Myc途径与结直肠病变的机制密切相关；HNPCC通路，由于多种基因搭配错误及其他因素引起微病灶不稳定，促进肿瘤无限制生长；在结直肠癌细胞中能观察到基因过度甲基化引起的雌激素失活，但对于此途径目前探究较少。EZp是有关学者采用酵母双杂交实验与原癌基因Vav蛋白产物相互作用过程中发现的人类新基因〔7〕。本研究发现，结直肠癌组织C、D期EZHZ阳性率高，有淋巴结转移也明显高于无淋巴结转移，原因可能为由p组蛋白27位赖氨酸甲基化作用于EZp上调时，可使抑制癌细胞的基因保持沉默，又因位于pRB-E2F通路下游区的EZp去磷酸化作用，pBb结合E2F抑制S期基因转录的启动，经过一系列作用最终促进瘤细胞增殖，且EZp表达上调可抑制某些肿瘤转移的抑制基因，临床表现为促进肿瘤发生与侵袭效果〔7〕。EZp可促使肿瘤浸润，这与上述EZp作用机制即通过HNPCC通路有关，在某种程度上会使正常结直肠组织恶化成瘤性组织。肿瘤组织发生转移，EZp可使抑制肿瘤转移基因保持沉默，临床效应为促使肿瘤转移〔8〕。当EZp上调时，EZp可使绝大部分抑癌基因沉默〔9〕。同时，EZp表达增高与肿瘤进展及预后差相关，推测其可能成为预测肿瘤预后的分子标记物。

综上所述，EZp基因可能与LoVo/5-Fu细胞株耐药机制有关，临床表现耐药细胞LoVo/5-Fu的EZp mRNA表达上调。提示EZp基因表达可能影响癌细胞对5-Fu敏感性；可通过EZp基因对结直肠肿瘤转移机制及病情进展进行判断。

4参考文献

1林琳,许庆文,刘春安.EZp和桩蛋白在结直肠癌组织的表达及其与临床病理参数及预后的关系〔J〕.中华实验外科杂志,2013;30(7):1520-1.

2马少卫.EZp、MTa-1在结直肠癌中表达及其临床意义〔D〕.石家庄：河北医科大学外科学硕士学位论文,2013.

3吕艳锋,韩冰冰,禹化龙,等.抑制EZp基因表达的shRNA载体的构建及其作用〔J〕.山东大学学报(医学版),2013;51(9):31-2.

4周桓.结直肠癌演进过程中CD133分子表达的临床意义及调控机制〔D〕.苏州：苏州大学免疫学博士学位论文,2013.

5Tamagawa D,Oshima T,Numata M,etal.Global histone modification of pK27 correlates with the outcomes in patients with metachronous liver metastasis of colorectal cancer〔J〕.Eur J Surg Oncol,2013;39(6):655-6.

6Ferraro A,Mourtzoukou D,Kosmidou V,etal.EZp is regulated by ERK/AKT and targets integrin alpha2 gene to control epithelial-mesenchymal transition and anoikis in colon cancer cells〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2013;45(2):243-54.

7王建新,吕艳锋,韩冰冰.靶向EZp基因的短发夹RNA表达载体的构建及其对人结肠腺癌SW480细胞的增殖抑制作用〔J〕.中华肿瘤杂志,2012;34(10):730-1.

8鞠海星,吴伟,胡锦林.结直肠癌中错配修复蛋白hMLH1和hMSp的表达及临床意义〔J〕.浙江临床医学,2014;16(4):505-7.

9Sponziello M,Durante C,Boichard A,etal.Epigenetic-related gene expression profile in medullary thyroid cancer revealed the overexpression of the histone methyltransferases EZp and SMYD3 in aggressive tumours〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2014;392(1-2):8-9.

〔2014-09-17修回〕

(编辑徐杰)

通讯作者：李品东(1981-)，男，博士，主要从事肿瘤研究。

〔中图分类号〕R735

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6436-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.058