中国西北地区披碱草属植物所带内生真菌的培养特征

宋辉，南志标，田沛

(草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

中国西北地区披碱草属植物所带内生真菌的培养特征

宋辉，南志标*，田沛

(草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

摘要：内生真菌与植物所形成的共生体普遍存在于冷季禾草中，共生体有利于提高宿主植物的生物和非生物抗性。虽然目前研究者们已对禾草内生真菌做了大量的研究，但是尚未发现对分布于中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌培养特征的研究。本研究从中国西北地区分离出15株来自不同地理种群披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌。通过分离培养，测定了这15株无性世代Neotyphodium内生真菌的菌落生长速度，结果显示，这15株无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的平均生长速度为(0.41～0.85) mm/d，且生长速度与海拔具有相关性。分布在海拔低于3000 m的无性世代Neotyphodium内生真菌的菌落生长速度比生长于海拔高于3000 m菌落的生长速度快。观察菌落发现，分布在海拔高于3000 m的菌落正面特征较为一致，而分布在海拔低于3000 m的菌落正面特征出现不同。另外，通过多基因联合建树发现，分布在海拔高于3000 m的无性世代Neotyphodium内生真菌聚在一个分支，而分布在海拔低于3000 m的无性世代Neotyphodium内生真菌呈现星状分布。由于目前尚未对中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌命名。因此，希望本研究结果能为该菌的命名提供理论依据。

关键词：内生真菌；披碱草；菌落；多样性；系统发育

Characteristic of asexual endophytes isolated fromElymusspecies in northwest China

SONG Hui, NAN Zhi-Biao*, TIAN Pei

KeyLaboratoryofGrasslandAgro-Ecosystems,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

Abstract:Forage grasses (Poaceae) often harbour endophytes belonging to the Neotyphodium and Epichlo⊇ (Clavicipitaceae, Ascomycota) genera. Neotyphodium endophytes, the asexual state of Epichlo⊇ species, helps to protect cool-season grasses against biotic and abiotic stresses including drought, disease, herbivory and parasitism and enhance aboveground and belowground vegetative and reproductive growth. There is little information on colonial diversity of asexual endophytes isolated from Elymus species in northwest Chinese. In the present study, different geographic populations of Elymus species were tested using the aniline blue screening method; 15 endophyte strains were isolated from endophyte positive plants. The average growth rate (on potato dextrose agar) of the isolated strains was 0.41-0.85 mm/day and was correlated with altitude. Endophyte strains isolated from regions below an altitude of 3000 m grew faster than strains isolated from regions above 3000 m. The colonial morphology of endophyte strains isolated from regions above 3000 m was similar whereas the colonial morphology of endophyte strains isolated from lower altitudes differed. In addition, the phylogenetic trees showed that endophytes collected above 3000 m were clustered whereas endophyte strains from lower altitudes demonstrated a star-like topology. The results will provide a theoretical basis for the identification of endophyte from northwest Chinese Elymus species.

Key words:endophyte; Elymus; colony; diversity; phylogeny

植物和其所带真菌(或细菌)形成的共生体广泛地分布在自然界中。这种互生共利的共生体能提高宿主植物对营养物质的吸收、提高对非生物胁迫的抗性以及通过产生生物碱避免昆虫的采食和病原菌的侵入[1-12]。在过去30多年中，研究者们已经做了大量的关于宿主植物和其所带内生真菌(endophyte)相互作用的研究。这里的内生真菌主要指的是子囊菌门(Ascomycota)麦角科(Clavicipitaceae)的有性世代Epichlo⊇和其所对应无性世代Neotyphodium。在这些研究中，研究者们发现了很多不同于其他植物和微生物所组成共生体的特征。Epichlo⊇(Neotyphodium)内生真菌广泛地分布在一些重要的牧草中，由于他们的侵入一方面能提高宿主植物的生物学特征；另一方面，一些侵入宿主植物的内生真菌产生的生物碱又会引起家畜中毒甚至死亡。因此，在全世界范围内引起了对Epichlo⊇(Neotyphodium)内生真菌的广泛研究。最近，Leuchtmann等[13]根据大量的基因组测序结果并结合形态学描述，将Epichlo⊇(Neotyphodium)进行了重命名。他们将所有内生真菌均命名为Epichlo⊇，原本的Neotyphodium被认为暂时没有发现其有性阶段，也被冠以Epichlo⊇。由于这种命名并不能很好地揭示无性世代Neotyphodium内生真菌的起源和传播。因此，在本文中仍采用原有的分类方法。

披碱草属(Elymus)植物隶属于禾本科小麦族，据统计大约有150种披碱草属植物分布在北半球，主要分布在北极地区至亚热带之间[14-15]。关于披碱草属植物内生真菌的系统研究仅限于分离于北美洲披碱草属植物有性世代Epichlo⊇内生真菌，研究者对该内生真菌进行了命名并分析了产生物碱的特征[16]。相反，中国特有披碱草属植物内生真菌的研究尚不系统，虽有研究者已经分离出中国特有披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌，但尚未对其命名，也未对其进行系统发育分析。Zhang和Nan[17-18]已报道了分离于中国地区披碱草(Elymusdahuricus)无性世代Neotyphodium内生真菌，并从内生真菌产生物碱和对宿主植物的影响等方面进行了研究。他们的研究表明，共生体所产的生物碱peramine的含量随季节变化，其中生长季末含量最高，另外，披碱草内生真菌能提高宿主植物的耐旱性和发芽率[19]。本文的主要目的是：1) 测定已分离于中国西北地区披碱草属植物内生真菌菌落的生长速度和观察菌落特征，为中国西北地区披碱草属植物内生真菌的命名提供理论依据。2) 通过测定已分离内生真菌微管蛋白基因(tubB)和延长因子基因(tefA)序列构建系统发育树，结合菌落生长速度，从分子生物学角度探讨这些内生真菌的系统发育关系。

1材料与方法

1.1　材料

在中国西北地区共采集234株披碱草属植物的种子和植株，采集省份包括宁夏、甘肃、青海。采集到的种子已播种到兰州大学榆中校区试验田。使用苯胺蓝染色法[20]检测这些披碱草属植物的带菌情况，带有内生真菌的披碱草属植物主要分布在甘肃和青海。详细信息见表1。

1.2　内生真菌的分离和培养

将经过表面消毒的披碱草属植物的茎秆或种子放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，25℃黑暗环境下培养。待茎秆或种子周围有菌丝长出后，使用经过无菌处理过的解剖针挑取少量菌丝于新鲜PDA培养。将PDA培养基置于25℃黑暗环境下培养4周[21]。为揭示生长速度和培养时间的关系，本研究对内生真菌菌落的生长速度采用十字法进行2次测量，第1次测量时间为内生真菌生长2周后(设置3个重复)，第2次测量时间为内生真菌生长4周后采用同样的方法进行测量。

1.3　内生真菌DNA的提取和扩增

使用OMEGA公司的真菌DNA试剂盒(D3195-01)提取无性世代Neotyphodium内生真菌DNA。本研究以微管蛋白基因(tubB)和延长因子基因(tefA)序列为分子标记构建披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌的系统发育关系。其PCR引物、反应程序以及反应体系参照Moon等[3]的方法。扩增tubB和tefA序列的引物为：tub-5: GAGAAAATGCGTGAGATTGT 和 tub-3: GTTTCGTCCGAGTTCTCGAC以及tef-5: GGGTAAGGACGAAAAGACTCA和tef-3: CGGCAGCGATAATCAGGATAG。PCR反应体系为：模板DNA，1 μL；引物各1 μL；2×taq master-mix，12.5 μL；使用无菌双蒸水补至25 μL。反应程序为：94℃预变性5 min，然后运行35个循环，分别是，94℃，30 s；45℃，45s(tefA：55℃，45 s)；72℃，1 min。最后，72℃延伸10 min。PCR产物经纯化后连接至pMD18-T载体(Takara, 大连)，利用PCR法筛选阳性克隆，每个样本的每个分子标记均挑选3～5个阳性克隆委托兰州励合生物进行序列测定。

1.4　数据分析

使用MAFFT 7.0 软件[22]对tubB和tefA序列进行多序列比对，对其结果使用GeneDoc软件[23]进行手工调整。然后使用SequenceMatrix软件[24]将2个序列合并为1条序列，并对其进行不相合长度差异检测(incongruence length difference test， ILD test)以检测2条序列是否适合联合建树。检测结果表明，合并后的序列完全适用于多序列联合建树。系统进化树由PAUP 4.0软件[25]采用ML方法构建。ML系统进化树的最佳模型为K80由Mrmodeltest软件[26]计算。构建的进化树均采用1000次随机取样重复，即自举值(bootstrap value)设置为1000。

此外，使用SPSS 17.0软件[27]对菌落生长速度进行分析。

2结果与讨论

2.1　菌落生长速度测定

通过对15株披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落生长速度的研究发现，无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的生长速度与宿主植物的生长区域具有特异相关性，而与宿主植物的种类没有特异性。分布在海拔低于3000 m不同宿主植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的生长速度(0.45～0.85) mm/d 显著大于海拔高于3000 m不同宿主植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的生长速度(0.41～0.65) mm/d (P<0.05)。

统计不同种类内生真菌菌落生长速度发现，内生真菌在不同时期具有不同的生长速度[28]。但是，本研究的结果却与此不同。在培养无性世代Neotyphodium内生真菌的4个星期过程中，菌落平均生长速度为(0.41～0.85) mm/d，前2周和后2周的菌落平均生长速度均为(0.42～0.83) mm/d。这3组数据表明，本研究无性世代Neotyphodium内生真菌菌落在不同生长时期的速度基本没有变化。进一步分析发现，分布在海拔低于3000 m披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落前2周的平均生长速度为(0.43～0.83) mm/d，而分布在海拔高于3000 m披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落前2周的平均生长速度为(0.42～0.63) mm/d。分布在海拔低于3000 m披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落后2周的平均生长速度为(0.43～0.83) mm/d，而分布在海拔高于3000 m披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落后2周的平均生长速度为(0.42～0.63) mm/d。海拔低于3000 m无性世代Neotyphodium内生真菌菌落4周的平均生长速度为(0.45～0.85)mm/d，而海拔高于3000 m无性世代Neotyphodium内生真菌菌落4周的平均生长速度为(0.41～0.65) mm/d。这些结果表明：1) 海拔低于3000 m无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的平均生长速度显著大于海拔高于3000 m无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的平均生长速度(P<0.05)。 2) 分布在不同地理区域的内生真菌在不同生长时期的平均生长速度基本相同。

有性世代和无性世代内生真菌的生长速度不同[28]。分离于北美洲披碱草属植物有性世代Epichlo⊇elymi内生真菌菌落的生长速度为(2.0～2.9) mm/d[16]。另外，通过分析tefA和tubB序列与其他已报道的内生真菌的系统发育关系时发现，本研究所分离的中国西北地区披碱草属植物无性世代内生真菌与分离Poapratensisssp.pratensis的有性世代Epichlo⊇liyangensis之间存在亲缘关系，而与分离于北美洲披碱草属植物有性世代的内生真菌并不存在亲缘关系，表明本研究分离的内生真菌与E.liyangensis存在共同祖先(未发表)。研究表明E.liyangensi的生长速率为(1.72～2.37) mm/d[29]。因此，不管是与分离于北美洲披碱草属植物有性世代E.elymi内生真菌相比，还是与分离于Poapratensisssp.pratensis的有性世代E.liyangensis内生真菌相比，本研究所分离的无性世代Neotyphodium内生真菌菌落的生长速度(0.41～0.85) mm/d均比较慢。这与无性世代Neotyphodium内生真菌的生长速度小于有性世代Epichlo⊇内生真菌的生长速度的结论相一致[30]。

通过观察披碱草属植物内生真菌菌落的形态特征，还发现一些规律。所有菌落背面形态相似，均为深褐色；但是，海拔低于3000 m无性世代Neotyphodium内生真菌的正面菌落存在一个球形(NI_201203、NI_201208)、半圆形(NI_201201、NI_201206和NI_201210)或无突起(NI_201221)(图1A)；而海拔高于3000 m无性世代Neotyphodium内生真菌的正面菌落存在一个类似“蒙古包”突起(图1B)。另外，麦宾草(Elymustangutorum)所带无性世代Neotyphodium内生真菌在不同海拔表现出不一样的菌落形态，而分布在海拔高于3000 m的菌落却出现相同的菌落形态特征(表1和图1)。这表明，披碱草属植物内生真菌的菌落特征与海拔具有特异性，而与宿主植物的种类无特异性。Karimi等[31]通过使用AFLP(amplified fragment length poly-morphisms)分子标记研究伊朗3种宿主植物(Festucaarundinacea,Festucapratensis和Loliumperenne)与无性世代Neotyphodium内生真菌的关系时发现，无性世代Neotyphodium内生真菌与宿主植物的地理分布具有特异性而与物种之间没有直接的特异性。另外，这一结论与Card等[32]使用SSR(simple sequence repeat)分子标记技术研究小麦族(Triticeae)植物，特别是大麦属和披碱草属植物的结果是一致的。但是，Simpson等[33]在新西兰发现了一株带有无性世代Neotyphodiumlolii内生真菌的矮化的黑麦草(Loliumperenne)，他们在分离这株矮化黑麦草的内生真菌时发现，该内生真菌的菌落形态与其他黑麦草N.lolii内生真菌的形态不一致。随后，他们将该形态不同的内生真菌接种到用杀菌剂处理后的黑麦草植物中，结果发现，原本正常生长的黑麦草竟然出现了矮化现象。这表明不同基因型的内生真菌可能会影响宿主植物的表型。

图1　中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落形态特征Fig.1　Colonial morphotype of asexual Neotyphodium endophytes from northwest Chinese Elymus species　　　A：海拔低于3000 m菌落形态特征；B：海拔高于3000 m菌落形态特征。A: Colonial morphotype regions below 3000 m; B: Colonial morphotype regions above 3000 m.

虽然本研究尚不能很好地解释披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌菌落形态不同的原因，但是本研究根据目前的结果并参考Sipmpon的研究结果大胆提出以下2个问题：1) 披碱草属植物内生真菌的菌落形态由于海拔差异而出现了不同，是不是内生真菌与不同地理区域披碱草属植物具有特异性？2) 是不是这两种不同菌落形态的内生真菌对宿主植物的影响不同？例如：哪种菌落形态下，宿主植物对生物或非生物的抗性更强？

表1　中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌生长速度

2.2　系统发育关系分析

与菌落培养特征相似，ML系统进化树同样反映出无性世代Neotyphodium内生真菌的聚类与海拔的相关性。由于NI_201207未克隆到tubB序列、NI_201209未克隆到tefA序列。因此在系统进化分析中缺少NI_201207和NI_201209。系统进化树中有一个主要分支(图2)，该分支包含所有海拔高于3000 m的披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌(自展率: 85)。相反，海拔低于3000 m的披碱草属植物内生真菌并不聚集在一起，而呈星状分布。虽然有研究表明，同一物种不成聚类分布的现象可能是由于基因重复(gene duplication)造成的[16,29-34]，但是披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌tubB、tefA和actB序列均未发现基因重复事件(未发表)。这可能是由于海拔低于3000 m的披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌与其宿主植物长期相互作用的结果。

图2　中国西北地区披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌系统发育关系Fig.2　Phylogenetic relationships of asexual Neotyphodium endophytes from northwest Chinese Elymus species

另外，环境因素也可能发挥着重要的作用。Iannone等[35]研究阿根廷Poabonariensis宿主植物的内生真菌发现，分布在干旱地区的P.bonariensis宿主植物带有内生真菌，而分布在潮湿草原中的P.bonariensis宿主植物则不带有内生真菌。本研究的披碱草属植物分布在中国西北较为干旱的地区。海拔高于3000 m的地方，昼夜温差更大并且紫外线更为强烈。或许昼夜温差和紫外线的强度是造成海拔高于3000 m的披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌聚集在一起的原因。相反，海拔低于3000 m的地方环境因素更为多变，如降雨量的不同，阴面和阳面的区别等。这些外界因素可能是使海拔低于3000 m披碱草属植物无性世代Neotyphodium内生真菌的菌落形态特征和在系统进化树上不成聚类的原因。不过，具体的机制有待进一步的研究。

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通讯作者*Corresponding author. E-mail：zhibiao@lzu.edu.cn

作者简介：宋辉(1985-)，男，山东鱼台人，在读博士。E-mail：songh12@lzu.edu.cn

基金项目：国家“973”项目(2014CB138702)和中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2014-76, lzujbky-2014-81)资助。

收稿日期：2014-10-09；改回日期：2014-11-17

DOI：10.11686/cyxb2014411http://cyxb.lzu.edu.cn