铁载体对肺炎克雷伯菌毒力增强的机制研究

陈 杨， 刘嘉琳， 瞿洪平

·综述·

铁载体对肺炎克雷伯菌毒力增强的机制研究

陈 杨， 刘嘉琳， 瞿洪平

肺炎克雷伯菌； 毒力因子； 铁载体

肺炎克雷伯菌是医院和社区获得性感染中最常见的革兰阴性致病菌之一，可引起肺炎、尿路感染、血流感染等。自1986年中国台湾首先报道肺炎克雷伯菌引起的社区获得性肝脓肿伴多发转移性脓肿后，国内外多所医院相继从肝脓肿患者分离出肺炎克雷伯菌，肺炎克雷伯菌导致的肝脓肿中高达78.3 %为亚洲患者[1]，这种肺炎克雷伯菌变异株被称为高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumonia， hvKP）。与经典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumonia， cKP）不同，hvKP具有高黏液性的特点，可引起健康青壮年的严重感染，使患者重要脏器发生化脓性感染（如肝脓肿）[2]，并且容易转移播散至脑脊液、眼、脾脏等其他部位[3-5]。正是由于hvKP导致的高致病性、高传播性以及高病死率，更突显了对肺炎克雷伯菌致病性研究的重要性和紧迫性[6]。目前研究认为，与肺炎克雷伯菌致病性相关的特征性毒力因子主要有荚膜多糖、脂多糖、菌毛、生物膜及铁载体等，其中荚膜多糖的合成增加与通过铁载体获得铁效率的增加共同组成肺炎克雷伯菌毒力增强的主要因素[7]，但其具体致病机制尚未完全明了，特别是铁载体在肺炎克雷伯菌毒力增强方面的研究成为普遍关注的亮点。

对于大多数生物来说，铁是其生长所必须的重要元素。铁作为辅助因子在生化代谢反应、电子传递等生命活动过程中发挥重要作用[8]。但三价铁离子（Fe3+）及其衍生物溶解性较低，大多数微生物难以直接利用，需通过合成并分泌铁载体来满足细菌对铁的需求并参与细菌生长与代谢。近年研究表明，病原微生物的铁载体还与它们的毒力相关，因为病原菌从宿主体内吸收铁是其繁殖和感染的必要步骤。通过铁载体获得铁的过程对肺炎克雷伯菌导致健康人群侵袭性感染的能力极为重要。实验感染模型显示许多产碳青霉烯酶（KPC）的肺炎克雷伯菌克隆菌株ST258/ST11即在肺炎克雷伯菌CC258中的耶尔森菌素增加了细菌在呼吸道定植和引发肺炎的能力[9-10]。这种具有耐药性的高毒力菌株导致治疗手段的缺乏，加大了临床治疗的难度。肺炎克雷伯菌表达多种铁载体以增强其在铁缺乏环境中获得铁的能力，其中已报道与毒力密切相关的铁载体系统有气杆菌素、肠杆菌素、沙门菌素和耶尔森菌素4种[11]，本文分别从蛋白和分子水平对这4种铁载体系统综述如下。

1　铁载体概述

铁载体是微生物在低铁条件诱导下合成的一类低分子量化合物，对Fe3+有特异的高亲和力，在微生物界分布广泛，种类和生物活性多样。微生物合成铁载体的同时在细胞外膜上产生特定受体蛋白即铁受体蛋白，它可以特异识别Fe3+-铁载体，将Fe3+输送到细胞内。铁载体及其特异性受体的生物合成需多个基因编码完成，这些基因通常在细菌染色体或质粒上组成一个基因簇。绝大多数微生物都可以合成铁载体，根据螯合铁的功能基团化学结构的不同，可将其分为4种类型即氧肟酸盐型、邻苯二酚盐型、羧酸盐型和混合型。细菌可以产生各种类型的铁载体，其中氧肟酸盐和邻苯二酚盐型铁载体在肠杆菌属中较常见，而绝大多数真菌只合成氧肟酸盐型铁载体。根据铁载体的不同类型现已发展了多种检测铁载体的方法[12-14]。其中，铬天青（CAS）检测法由于其快速、灵敏、准确等优点成为目前最普遍应用的检测方法。CAS检测法不依赖于铁载体的结构，而是通过铁载体与Fe3+螯合作用产生的显色反应来定性、定量测定铁载体。铁载体的功能多样，对微生物的铁营养起至关重要的作用，也是某些病原菌的毒力因子。病原菌通过高效的铁摄取系统从宿主细胞中获取铁，从而实现毒力作用：首先，病原菌合成的铁载体大多数与宿主转铁蛋白中的铁结合形成Fe3+-铁载体复合物，由细菌外膜上的铁受体蛋白识别并将铁释放入细胞内，使胞内Fe3+浓度增加，促进细菌生长繁殖，造成细菌感染加重或扩散；此外，铁载体还可催化羟基自由基生成，进一步加重组织损伤，辅助细菌的生长繁殖[15]。

2　增强肺炎克雷伯菌毒力相关的铁载体类型和特点

研究表明，在加入人类腹水的培养基或贫铁的基本培养基上培养hvKP和cKP，铁载体定量试验（CAS检测法）测得毒力更强的肺炎克雷伯菌均可分泌数量更多、活性更强（可能为细菌结合利用铁的效率增加和细菌对宿主的抵抗力增强）的铁载体，这可能是肺炎克雷伯菌增强其毒力的重要机制[16-17]。4种铁载体系统的气杆菌素、肠杆菌素、沙门菌素和耶尔森菌素，在肺炎克雷伯菌毒力增强中发挥的作用和特点各有不同。

2.1气杆菌素

气杆菌素是大多数肠杆菌科病原体分泌的一种氧肟酸盐与羧酸盐混合型铁载体蛋白，与铁亲和力较低。在侵袭性感染的过程中细菌与宿主组织的关系密切，而研究发现气杆菌素主要从宿主组织细胞中运载铁，这可能是侵袭性菌株更容易分泌气杆菌素的原因[15]。虽然肺炎克雷伯菌自身不能合成气杆菌素，但它可以高效利用其他微生物合成的气杆菌素。有研究者通过PCR扩增技术比较hvKP和cKP中编码气杆菌素及其受体基因簇（iucABCD-iutA）的分布情况，发现基因簇在hvKP中更普遍存在[11]，说明肺炎克雷伯菌毒力增强可能是由于气杆菌素产量的增加。尽管hvKP中气杆菌素产量增加的机制目前仍不清楚，但已经明确在铁贫乏的条件下气杆菌素是hvKP铁载体蛋白含量增加的主要因素，并且气杆菌素是hvKP铁载体中最重要的毒力因子。RUSSO等[16，18]报道，把hvKP与cKP分别在加入人类腹水的合成培养基或贫铁的基本培养基上培养，定量测定铁载体蛋白总产量，结果发现hvKP铁载体蛋白总产量增加更为显著，且通过质谱分析法测得其中气杆菌素产量占铁载体蛋白总产量的90 %；在小鼠腹腔内注射hvKP的感染模型中，单独敲除气杆菌素编码基因的小鼠存活率明显高于野生型小鼠和分别单独敲除其余铁载体合成基因的小鼠，进一步说明气杆菌素是hvKP铁载体中最重要的毒力因子。细菌毒力的增强大多是因为基因的水平性转移，研究发现iucABCD-iutA、亚碲酸盐抗性因子（TerW）、黏液表型调节因子（RampA）和银抗性因子（SilS）等因子的编码基因在大小约220 kb的毒力质粒上同时存在，水平获得此毒力质粒的肺炎克雷伯菌毒力增强，更易引起宿主形成肝脓肿等严重的转移性感染[19]。

2.2肠杆菌素

肠杆菌素是肠杆菌科病原体（包括肺炎克雷伯杆菌）产生的一种最常见的典型邻苯二酚盐型铁载体蛋白。与其他已知的铁载体蛋白相比，肠杆菌素具有最高的铁亲和力[20]，主要与血浆转铁蛋白中的铁结合，促进细菌生长而引起细菌感染。为了阻碍肠杆菌素结合铁，宿主的中性粒细胞和黏膜上皮细胞产生固有免疫蛋白Lcn2螯合肠杆菌素，抑制血管周围细菌的定植生长，防止感染的播散，间接表明肠杆菌素可能对于深部组织的穿透性感染有重要作用[9]。肺炎克雷伯菌的临床分离株均可合成肠杆菌素，其合成基因簇为entABCDEF[11]。虽然肠杆菌素在动物模型中的感染机制尚不清楚[21]，但其合成基因entB的表达过多可产生更多的铁载体使细菌获得更多的铁，而细菌内环境中铁的增加能促进生物膜的早期形成使hvKP毒力增强[22-23]，这间接说明肠杆菌素的增加使肺炎克雷伯菌毒力增强。

2.3沙门菌素

沙门菌素为大肠埃希菌、沙门菌和克雷伯菌产生的一种邻苯二酚盐型铁载体蛋白，可被看作糖基化的肠杆菌素，具有较高的铁亲和力[24]。宿主产生的固有免疫蛋白Lcn2不能与沙门菌素结合，从而使沙门菌素可以螯合铁促进细菌的复制，造成细菌感染加重或扩散，增强细菌对宿主的毒力作用[25-26]。在细菌感染过程中邻苯二酚盐型铁载体（包括肠杆菌素和沙门菌素）发挥特征性抗氧化剂的作用，催化羟基自由基的生成，加重对组织的损伤作用从而增强细菌的毒力[27]。沙门菌素由基因簇iroA（iroBCDN）编码合成，沙门菌素和气杆菌素的合成基因簇均位于一个大小约为200～220 kb的毒力质粒上，水平转移性获得此毒力质粒的肺炎克雷伯菌表达高黏液性表型，毒力增强引起机体严重的转移性感染[28-30]。沙门菌素的受体蛋白由基因iroN编码，iroN可调节肠杆菌素、沙门菌素等铁载体蛋白的摄取，在细菌侵袭性感染时具有重要的辅助作用[31]。

2.4耶尔森菌素

耶尔森菌素是由耶尔森菌属高致病性菌分泌的混合型铁载体蛋白，其主要功能基团为酚盐和羧酸盐，具有中等的铁亲和力[32]。通过PCR扩增技术比较hvKP和cKP中编码合成耶尔森菌素及其受体的基因簇分布情况，发现基因簇在hvKP中更普遍存在，说明hvKP毒力增强可能是由于耶尔森菌素产量的增加[11]。耶尔森菌素通过规避与宿主固有免疫机制相关蛋白（Lcn2）的结合造成呼吸道的严重感染[9]。在贫铁条件下，耶尔森菌素通过激活外膜蛋白FyuA来促进生物被膜的形成从而增强细菌的毒力[33]。PAAUW等[34]报道耶尔森菌素和气杆菌素通过阻断活性氧的产生间接降低宿主固有免疫细胞的杀菌能力，从而增强细菌的毒力。对目前已测序的NTUH-K2044 hvKP菌株进行相关数据分析发现，耶尔森菌素在hvKP中由可移动的整合性结合元件（ICEKp1）上类似耶尔森鼠疫杆菌的强毒力岛基因簇ybt、irp1、irp2、fyuA编码合成、转运和调节[29，35]。强毒力岛（耶尔森菌素合成基因簇），iuc（气杆菌素合成基因簇）和iroA（沙门菌素合成基因簇）区域与hvKP均密切相关，因此在cKP向hvKP进化的过程中以上基因簇可以作为水平获得性毒力基因位点的代表[36]，从基因水平上解释hvKP毒力增强的原因。

3　总结

在hvKP中广泛存在的各种铁载体蛋白使其较cKP具有更强的铁离子获取能力，并且这与hvKP的高毒力密切相关。在铁贫乏的条件下，气杆菌素一方面是hvKP铁载体蛋白含量高的主要因素，另一方面也是hvKP铁载体中最重要的毒力因子。尽管已有相关hvKP的铁载体蛋白的研究，但很多机制依然无法阐释，例如hvKP为何会分泌更多的铁载体蛋白、感染发展不同时相对铁载体蛋白产量的影响、铁载体中最重要的气杆菌素其哪些特征直接增强了肺炎克雷伯菌的毒力等这些问题都亟待解决。对肺炎克雷伯菌铁载体运输系统的研究，旨在阐明铁载体利用与细菌毒力之间的关系，阐明铁载体在引起感染过程中的内在机制和作用规律，进而达到抑制病原菌生长、预防疾病，拓宽治疗途径的目的，为临床治疗提供全面而有效的信息。

[1] SIU LK， YEH KM， LIN JC， et al. Klebsiella pneumoniae liver abscess： a new invasive syndrome[J]. Lancet Infec Dis， 2012，12（11）：881-887.

[2] KELLER JJ， TSAI MC， LIN CC， et al. Risk of infections subsequent to pyogenic liver abscess： a nationwide populationbased study[J]. Clin Microbiol Infect， 2013， 19（8）：717-722.

[3] SOON WC， POUNCEY A， ASHLEY E， et al. Klebsiella pneumoniae infection： a virulent cause of visual loss[J]. Case Rep Ophthalmol， 2014， 5（3）：468-473.

[4] LIN YT， LIU CJ， CHEN TJ， et al. Long-term mortality of patients with septic ocular or central nervous system complications from pyogenic liver abscess： a population-based study[J]. PLoS One， 2012， 7（3）：e33978.

[5] LEE WS， CHOI ST， KIM KK. Splenic abscess： a single institution study and review of the literature[J]. Yonsei Med J，2011， 52（2）：288-292.

[6] LI W， SUN G， YU Y， et al. Increasing occurrence of antimicrobial-resistant hypervirulent （hypermucoviscous）Klebsiella pneumoniae isolates in China[J]. Clin Infect Dis，2014， 58（2）：225-232.

[7] SHON AS， BAJWA RP， RUSSO TA. Hypervirulent（hypermucoviscous） Klebsiella pneumoniae： a new and dangerous breed[J]. Virulence， 2013， 4（2）：107-118.

[8] MIETHKEM， MARAHIEL MA. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2007， 71（3）：413-451.

[9] BACHMAN MA， LENIO S， SCHMIDT L， et al. Interaction of lipocalin 2， transferrin， and siderophores determines the replicative niche of Klebsiella pneumoniae during pneumonia[J]. MBio， 2012， 3（6）：e00224-11.

[10] HOLT KE， WERTHEIM H， ZADOKS RN， et al. Genomic analysis of diversity， population structure， virulence， and antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae， an urgent threat to public health[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2015， 112（27）：e3574-e3581.

[11] HSIEH PF， LIN TL， LEE CZ， et al. Serum-induced ironacquisition systems and TonB contribute to virulence in Klebsiella pneumoniae causing primary pyogenic liver abscess[J]. J Infect Dis， 2008， 197（12）：1717-1727.

[12] FINNIN MS， DONIGIAN JR， COHEN A， et al. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors[J]. Nature， 1999， 401（6749）：188-193.

[13] SCHWYN B， NEILANDS JB. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. Anal Biochem，1987， 160（1）：47-56.

[14] SPASOJEVIC I， ARMSTRONG SK， BRICKMAN TJ， et al. Electrochemical behavior of the Fe（Ⅲ） complexes of the cyclic hydroxamate siderophores alcaligin and desferrioxamine E[J]. Inorg Chem， 1999， 38（3）：449-454.

[15] HOLDEN VI， BACHMAN MA. Diverging roles of bacterial siderophores during infection[J]. Metallomics， 2015， 7（6）：986-995.

[16] RUSSO TA， OLSON R， MACDONALD U， et al. Aerobactin mediates virulence and accounts for increased siderophore production under iron-limiting conditions by hypervirulent（hypermucoviscous） Klebsiella pneumoniae[J]. Infect Immun，2014， 82（6）：2356-2367.

[17] RUSSO TA， SHON AS， BEANAN JM， et al. Hypervirulent K. pneumoniae secretes more and more active iron-acquisition molecules than "classical" K. pneumoniae thereby enhancing its virulence[J]. PLoS One， 2011， 6（10）：e26734.

[18] RUSSO TA， OLSON R， MACDONALD U， et al. Aerobactin，but not yersiniabactin， salmochelin， or enterobactin， enables the growth/survival of hypervirulent （hypermucoviscous） Klebsiella pneumoniae ex vivo and in vivo[J]. Infect Immun， 2015， 83（8）：3325-3333.

[19] TANG HL， CHIANG MK， LIOU WJ， et al. Correlation between Klebsiella pneumoniae carrying pLVPK-derived loci and abscess formation[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2010，29（6）：689-698.

[20] LI B， ZHAO Y， LIU C， et al. Molecular pathogenesis of Klebsiella pneumoniae[J]. Future Microbiol， 2014， 9（9）：1071-1081.

[21] LAWLOR MS， O'CONNOR C， MILLER VL. Yersiniabactin is a virulence factor for Klebsiella pneumoniae during pulmonary infection[J]. Infect Immun， 2007， 75（3）：1463-1472.

[22] MAY T， OKABE S. Enterobactin is required for biofilm development in reduced-genome Escherichia coli[J]. Environ Microbiol， 2011， 13（12）：3149-3162.

[23] WU MC， LIN TL， HSIEH PF， et al. Isolation of genes involved in biofi lm formation of a Klebsiella pneumoniae strain causing pyogenic liver abscess[J]. PLoS One， 2011， 6（8）：e23500.

[24] BISTER B， BISCHOFF D， NICHOLSON GJ， et al. The structure of salmochelins： C-glucosylated enterobactins of Salmonella enterica[J]. Biometals， 2004， 17（4）：471-481.

[25] BACHMAN MA， MILLER VL， WEISER JN. Mucosal lipocalin 2 has pro-inflammatory and iron-sequestering effects in response to bacterial enterobactin[J]. PLoS Pathog， 2009， 5（10）：e1000622.

[26] KOOTI S， MOTAMEDIFAR M， SARVARI J. Antibiotic resistance profi le and distribution of oxacillinase genes among clinical isolates of Acinetobacter baumannii in Shiraz Teaching Hospitals， 2012-2013[J]. Jundishapur J Microbiol， 2015， 8（8）：e20215.

[27] ACHARD ME， CHEN KW， SWEET MJ， et al. An antioxidant role for catecholate siderophores in Salmonella[J]. Biochem J，2013， 454（3）：543-549.

[28] RUSSO TA， GILL SR. Draft genome sequence of the hypervirulent Klebsiella pneumoniae strain hvKP1， isolated in Buffalo， New York[J]. Genome Announc， 2013， 1（2）：e0006513.

[29] WU KM， LI LH， YAN JJ， et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044， a strain causing liver abscess and meningitis[J]. J Bacteriol， 2009，191（14）：4492-4501.

[30] CHEN YT， CHANG HY， LAI YC， et al. Sequencing and analysis of the large virulence plasmid pLVPK of Klebsiella pneumoniae CG43[J]. Gene， 2004， 337：189-198.

[31] MULLER SI， VALDEBENITO M， HANTKE K. Salmochelin，the long-overlooked catecholate siderophore of Salmonella[J]. Biometals， 2009， 22（4）：691-695.

[32] BACHMAN MA， OYLER JE， BURNS SH， et al. Klebsiella pneumoniae yersiniabactin promotes respiratory tract infection through evasion of lipocalin 2[J]. Infect Immun， 2011， 79（8）：3309-3316.

[33] HANCOCK V， FERRIERES L， KLEMM P. The ferric yersiniabactin uptake receptor FyuA is required for efficient biofi lm formation by urinary tract infectious Escherichia coli in human urine[J]. Microbiology， 2008， 154（Pt 1）：167-175.

[34] PAAUW A， LEVERSTEIN-VAN HALL MA， VAN KESSEL KP， et al. Yersiniabactin reduces the respiratory oxidative stress response of innate immune cells[J]. PLoS One， 2009， 4（12）：e8240.

[35] STRUVE C， ROE CC， STEGGER M， et al. Mapping the evolution of hypervirulent Klebsiella pneumoniae[J]. MBio，2015， 6（4）：e00630.

[36] CHEN Z， LIU M， CUI Y， et al. A novel PCR-based genotyping scheme for clinical Klebsiella pneumoniae[J]. Future Microbiol，2014， 9（1）：21-32.

Mechanistic research on the role of siderophores in enhancing the virulence of Klebsiella pneumoniae

CHEN Yang, LIU Jialin, QU Hongping. （Intensive Care Unit, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200020, China）

R378.996

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0804-04

10.16718/j.1009-7708.2016.06.025

上海交通大学“医工交叉基金”（YG2014MS57）

上海交通大学医学院附属瑞金医院重症医学科，上海200020。

陈杨（1991―），女，硕士研究生，主要从事肠杆菌科细菌致病机制研究。

瞿洪平，E-mail: hongpingqu0412@hotmail.com。

2016-02-01

2016-03-24