经皮免疫机制及其在过敏性疾病的应用进展

刘笑纯 姚煦

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所过敏与风湿免疫科

·综述·

经皮免疫机制及其在过敏性疾病的应用进展

刘笑纯 姚煦

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所过敏与风湿免疫科

经皮免疫作为一种新型免疫治疗途径，是将抗原和佐剂局部应用于皮肤，诱导机体产生系统性免疫应答的接种方式，该方法安全有效，有望成为具有吸引力的传统疫苗替代途径。经皮免疫诱导不同方向免疫反应，但是皮肤免疫耐受方面的具体机制尚未完全明确。大多数研究基于动物模型，动物与人类皮肤存在结构差异，需建立更多研究实现动物模型向人体的转化。并非所有的疫苗都适用于皮肤接种，研究必须评估其安全性和有效性。各种改良的疫苗递送系统及其在相关疾病上的临床应用尚待进一步发掘。

皮肤疾病；过敏反应；免疫；疫苗；治疗应用

皮肤富含免疫细胞和免疫分子，具有一套调控精密的免疫网络。经皮免疫（transcutaneous immunization，TCI）是将抗原和佐剂局部应用于皮肤，诱导机体产生系统性免疫应答的一种新型免疫治疗途径。与传统针剂注射疫苗相比，TCI疫苗避免了血源性感染，不经过胃肠道降解，作用更为稳定持久，成为新型疫苗发展的趋势。

一、经皮免疫概况

自20世纪下半叶，皮肤免疫系统的理论逐渐得到关注。1996年，Wang等［1］发现小鼠皮肤表面敷贴卵清蛋白抗原后，血清中检测到较高水平的特异性IgE和IgG1，诱导机体产生Th2为主的免疫应答。Glenn等［2］发现，霍乱菌素可透过小鼠完整皮肤，引发强烈的免疫反应，阐述了TCI的概念，并证实霍乱毒素同时可作为佐剂应用的可行性。此后数年内，对某些细菌、病毒等抗原、佐剂及相应疫苗递送系统的研究逐步深入。目前，TCI作为一种新型免疫治疗途径仍处于实验室研究，针对防治某些感染性疾病和肿瘤设计的疫苗部分已进入临床试验阶段，主要方向集中在抗原、佐剂和皮肤促渗技术等方面。

二、皮肤免疫系统

皮肤通过精密复杂的免疫网络抵御外来病原微生物入侵。皮肤主要的免疫细胞包括角质形成细胞（KC）和朗格汉斯细胞（LC），以及成纤维细胞、T 淋巴细胞、树突细胞（DC）、巨噬细胞、肥大细胞和先天淋巴样细胞。此外还有多种细胞因子、免疫球蛋白、补体、神经肽等免疫分子［3］，参与构成了皮肤免疫网络。KC分泌多种细胞因子、趋化因子和抗微生物肽，表面的Toll样受体是识别病原微生物及其组分的重要物质。LC是表皮特征性DC，特异性表达凝集素受体Langerin。侵入表皮的抗原可被LC识别、摄取和加工，运送至局部引流淋巴结，提呈给初始T细胞启动免疫应答。肿瘤坏死因子（TNF）α和白细胞介素（IL）1β参与动员LC的迁移，上调整合素α6、CD54、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达，促进LC成熟。表皮屏障结构完整时，LC负责监视外来抗原，维持皮肤免疫耐受。成纤维细胞是真皮的主要成分，可表达Toll样受体1～10［4］，释放IL-6、角质细胞生长因子和血管内皮生长因子等，与KC一道参与维持皮肤免疫系统稳态。dDC可在整个真皮层不断迁移，发挥免疫监视作用。在炎症早期，dDC从真皮动员至引流淋巴结，可能参与诱导初始T细胞对病原体的免疫应答［3］。不同dDC亚群在促进Th1或Th2反应的作用上有所不同［5-6］，Langerin+dDC参与活化细胞毒性T淋巴细胞，促进Th1反应，抑制Th17细胞分化；Langerin-dDC主要在Th2细胞发育早期发挥作用。

皮肤中的肥大细胞、常驻T细胞以及淋巴结内初始T和B淋巴细胞是主要的免疫效应细胞。真皮中的肥大细胞参与IgE介导的超敏反应，能对多种刺激产生应答，分泌一系列促炎细胞因子和趋化因子，介导T细胞免疫应答方向的极化。初始T和B细胞位于皮肤引流淋巴结，被迁移至局部的抗原提呈细胞激活，在此发生特异性免疫应答。真皮常驻γδT细胞分泌IL-17，可以募集中性粒细胞参与对病原体的先天性防御，并诱导IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子分泌，启动早期炎症反应。除此之外，多种细胞因子参与体液或细胞免疫，进一步增强免疫效应。

三、经皮免疫机制

通过皮肤接种是最有效的刺激皮肤归巢效应T细胞的方式。TCI抗原主要经表皮LC摄取，另外CD14+dDC和能够交叉提呈的CD141hidDC也参与该过程。LC和dDC携带被加工抗原迁移至引流淋巴结，通过MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子提呈给初始CD4+和CD8+T细胞。CD14+dDC优先诱导Th1极化反应，激活CD4+T细胞分化成Th1细胞和滤泡辅助性T细胞。CD141hiDC能将外源性抗原交叉提呈给外周CD8+T细胞，可与LC一道与CD8+T细胞相互作用，诱导其分化为细胞毒性T淋巴细胞，分泌IL-2和IFN-γ，介导细胞免疫。与皮内免疫相比，由于抗原提呈细胞不同亚群的参与，TCI产生的免疫应答更为显著。表达在树突细胞表面的内肽酶、外肽酶及血清来源的蛋白酶可以修剪抗原，导致T细胞表位片段缺失，而经皮免疫持续长时的给药，提供了稳定的表位呈递，从而补偿了蛋白水解造成的表位损失。另外，皮肤中KC、LC［7］、γδT 细胞［8］和肥大细胞［9］等之间复杂的相互作用提高了抗原经皮致敏能力。

Novak等［10］首次提出皮肤的完整性在TCI中的重要性。当皮肤屏障结构完整时，静息状态的LC通过树突在KC间形成网络，能特异性地选择并诱导CD4+Foxp3+调节性T细胞活化和增殖［11］，抑制T细胞活化，以维持外周免疫耐受；而当屏障功能受损，外界抗原刺激下，活化的LC诱导病原体特异性效应记忆T细胞和记忆调节性T细胞增殖，限制调节性T细胞活化［12］。皮肤屏障破坏还可激活KC分泌IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎症细胞因子，促进LC的成熟和迁移，通过启动类似固有免疫应答的炎症过程充当佐剂。此外，不完整的皮肤屏障也可诱导抗微生物肽表达升高，参与固有免疫。由此可见，完整的皮肤是诱导耐受的前提。但有研究发现，即使在炎症刺激下，LC也能够诱导初始T细胞的免疫耐受，免疫活化绝大多数通过快速迁移的dDC介导［13］。也有实验表明，在经皮应用抗原后最初发生反应的是dDC而非LC，LC在应答早期呈现无反应状态［14］。

四、经皮免疫疫苗研究应用

鉴于皮肤中有丰富的不同活性的免疫细胞，根据TCI设计的疫苗具有更高的靶向性，诱导产生的免疫效应更为显著。与传统疫苗相比，TCI疫苗是一种安全有效、有望替代传统针剂注射的新途径［15］，可用于治疗感染性、自身免疫性疾病和肿瘤，也成为过敏原特异性免疫治疗的新选择。

1.经皮给药系统：TCI疫苗包括各种细菌或病毒的减毒活疫苗、组分疫苗、基因工程疫苗等，另外一些蛋白质、多糖组分或重组DNA技术制备的过敏原也可作为疫苗抗原。一般认为，抗原经皮免疫有胞内渗透、胞间渗透和毛囊渗透3种途径。角质层具有完整而强大屏障结构，需应用各种递送系统及佐剂使疫苗易于穿透。疫苗载体可以稳定活化的疫苗，将其靶向至皮肤特定区域，或协同作为佐剂。最初实验研究常用皮肤贴剂搭载抗原，目前常用的新型疫苗载体有纳米颗粒、病毒样载体、大肠杆菌、囊泡系统、微乳等，其中纳米颗粒或微粒由于性质稳定、释放可控和易被摄取，能有效增强抗原的免疫原性［16］，已被广泛研究。一些促渗剂（如乙醇、二甲基亚砜、油酸），以及物理促渗技术（如低频超声、微针、离子导入、电穿孔、基因枪）的应用，也用于促进经皮传递。其他递送技术，如水凝胶贴剂［17-18］和经毛囊递送［19-20］逐步显示其优越性。佐剂的选择主要根据反应类型的不同，包括ADP核糖基化外毒素、CpG基序、Toll样受体配体和某些细胞因子等。不同特性的递送系统诱导不同方向的免疫反应，如激光微孔技术可以诱导Th2反应，而CpG寡脱氧核苷酸作为佐剂能抑制IL-4、IL-5和IL-13的产生，调节免疫反应向Th1方向极化，二者的联合可以调节Th1/Th2反应之间的平衡［21］。Zaric等［22］利用溶解性聚合物微针阵列载入纳米胶囊包裹抗原，特异性靶向皮肤DC网络，该反应中，LC能交叉激活抗原特异性CD8+T细胞，促进CD4+Th1和Th17细胞分化。不同趋化因子及其受体的差异性表达可以调节LC向引流淋巴结的迁移［23］，通过疫苗载体搭载特定的趋化因子能一定程度上调控免疫效应细胞和分子。

2.TCI疫苗在过敏性疾病中的应用：过敏原特异性免疫治疗是唯一能够阻止过敏性疾病病情进展的具有长期疗效的治疗途径［24］，而传统的皮下免疫方法由于其疗程长，过敏原若经针剂入血可能引发全身不良反应，患者依从性不高。皮肤是发生免疫耐受诱导的理想部位，由于皮肤中具有丰富的抗原提呈细胞，TCI疫苗能有效增强疗效，缩短疗程，减少非特异性反应的发生。有双盲、安慰剂对照研究表明，经皮过敏原特异性免疫治疗能够显著改善患者过敏症状［25］，治疗中过敏原特异性IgG4升高。一项针对儿童季节性过敏性结膜炎的前瞻性研究［26］显示，每周应用含过敏原的皮肤贴片24 h治疗12周后，患儿的过敏症状显著改善，抗组胺药使用量减少，且未出现局部或全身不良反应。

早在1957年，就有研究者尝试将过敏原提取物反复应用于破损皮肤来治疗花粉和尘螨过敏。有实验发现，在小鼠正常无损皮肤上外用抗原可以诱导机体产生Th1型细胞因子和IL-10，局部引流淋巴结内CD4+Foxp3+调节性T细胞数量增多，高浓度抗原外用可以有效抑制皮下免疫所诱导的应答反应［27］。与一般TCI疫苗不同，过敏原疫苗需具备针对皮肤DC更高的靶向性，通过佐剂抑制过敏原特异性Th2反应的启动，减少IL-4和IL-5的产生，增加IFN-γ分泌，诱导Th1反应的极化。既往研究发现，利用胶带剥离造成小鼠皮肤角质层破坏可以诱导IL-12和IFN-γ的产生，上调MHC-II类分子及LC表面CD11c和CD86、CD40、CD54的表达，有助于过敏原保护性免疫反应的诱导。近年来，应用各种新型皮肤递送系统优化疫苗设计，减少了非特异性免疫反应的发生。利用激光微孔技术针对变应性哮喘小鼠进行经皮过敏原治疗，发现疫苗可诱导IgG2a和Foxp3+CD4+T细胞增多，下调Th1/Th2/Th17反应，显著抑制相关促炎因子的产生［28］。一种新型纳米疫苗载体DermAll［29］，含有特征性表达卵清蛋白的质粒DNA，能减少IL-4和IL-5分泌，阻止过敏原诱导的Th2反应的进展，平衡Th1/Th2反应，有效减轻致敏小鼠过敏症状。偶联碳水化合物的过敏原能特异性靶向至抗原提呈细胞，并通过掩盖B细胞表位使疫苗分子呈现低变应原性［30］。需注意的是，由于真皮富含肥大细胞，皮肤屏障破坏及高剂量的过敏原可能引起局部瘙痒、红斑、风团甚至全身过敏等不良反应，但当皮肤贴剂应用次数增加，局部不良反应也随之减弱，其安全性还需更深入的评估。

五、结语

TCI优于传统免疫接种方式，具有广阔的应用前景，对多种疾病特别是过敏性疾病的防治有重要意义。TCI诱导不同方向免疫反应，尤其是皮肤免疫耐受方面的具体机制尚未完全明确。大多数研究基于动物模型，但动物与人类皮肤存在结构差异，需建立更多研究实现动物模型向人体的转化。并非所有的疫苗都适于皮肤接种，研究中必须评估其安全性和有效性。各种改良的疫苗递送系统及其在相关疾病上的临床应用尚待进一步发掘。

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Mechanisms of transcutaneous immunization and its application in allergic diseases

Liu Xiaochun,Yao Xu

Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Transcutaneous immunization（TCI）is a novel immunotherapy approach that induces systemic immune responses via topical application of antigens and adjuvants onto the skin.It is a safe and effective method,and is expected to serve as an attractive alternative to traditional vaccination.TCI induces immune responses in different directions,but the exact mechanism of skin immune tolerance is still unclear.Most studies on TCI are based on animal models.However,there are structural differences between animal skin and human skin,so more researches are needed to achieve the translation of TCI from bench to bedside.Not all vaccines are suitable for cutaneous inoculation,so vaccines for TCI should be evaluated for their safety and efficacy.Various reformed vaccine delivery systems are needed to be further explored in related diseases.

Skin diseases;Anaphylaxis;Immunity;Vaccines;Therapeutic uses

Yao Xu,Email:dryao_xu@126.com

姚煦，Email：dryao_xu@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.024

国家自然科学基金（81171501、81371735、81573045）；江苏省自然科学基金（BK20150166）；2014 年亚美医学基金会（MMAAP）皮肤病项目基金

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171501,81371735,81573045）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China （BK20150166）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014

2015-10-14）

（本文编辑：吴晓初）