糖络通对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经细胞凋亡及抗氧化酶表达的影响

关键词〔〕糖尿病周围神经病变；凋亡；氧化应激；抗氧化酶

1河北医科大学中西结合学院

第一作者：常庚(1981-)，男，医学博士，主治医师，主要从事中西医结合对神经系统疾病的研究。

氧化应激是糖尿病周围神经病变(DPN)发病机制中的关键因素，抑制氧化损伤成为目前治疗DPN的关键环节。本研究依据中医“久病入络”的理论，用自拟方糖络通观察其对大鼠DPN的疗效，通过检测坐骨神经细胞凋亡数目、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、血清8-羟基脱氧鸟苷(8-OhdG)的含量以及抗氧化蛋白谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达，探讨糖络通减轻神经细胞氧化损伤的机制。

1材料与方法

1.1实验动物健康清洁级Wistar雄性大鼠90只，体重150～180 g，鼠龄4～6 w，由河北省医学实验动物中心提供。

1.2药品及试剂糖络通组成：黄芪、红花、怀牛膝、赤芍、生地、威灵仙、当归、蜈蚣、桂枝等(购自乐仁堂药房，经河北医科大学中药系鉴定，符合国家药典标准)，在我校中药系指导下常规水煎，浓缩至含生药3 g/ml，备用。测定LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量的试剂来自南京建成生物工程研究所；链脲佐菌素购自美国Sigma公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司。

1.3模型建立及分组按文献〔1〕方法复制模型。造模组大鼠禁食12 h后，链脲佐菌素(STZ)(溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液中，pp.3)50 mg/kg一次性腹腔注射，72 h后通过尾静脉测定血糖，>16.67 mmo/L者为造模成功。造模过程中除2只未成模外，其余全部成模。将造模成功的大鼠再随机分为模型组及中药干预组。正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。

1.4实验动物给药中药干预组：每日给糖络通中药25 g/kg(相当于成人剂量的20倍)。正常对照组、模型组：每日给相同容量的生理盐水灌胃。中药干预共8 w。

1.5标本采集中药干预8 w后禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛完全麻醉后，心腔取血，4℃ 3 500 r/min离心15 min，分离血清及血浆，置于-20℃密封保存备用。剖取坐骨神经，取部分组织固定于4%的甲醛溶液中，常规固定、脱水，石蜡包埋，切片以供检测细胞凋亡等备用。其余坐骨神经组织制成匀浆，以供检测LDH 活性、MDA含量。

1.6TUNEL法测定细胞凋亡率应用TUNEL法检测坐骨神经细胞凋亡，操作步骤按说明书。

1.7坐骨神经组织生化测定采用比色法测定组织匀浆中的LDH 活性、硫代巴比妥酸法测定MDA含量，二硫代二硝苯甲酸法则定GSH-Px含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量，测试操作过程严格按照说明书进行。

1.8血清8-OhdG的含量检测应用ELISA法测定血清8-OhdG的含量，操作步骤按说明书。

1.9统计学方法采用SPSS11.0软件进行方差分析。

2结果

2.1坐骨神经细胞凋亡数目及坐骨神经组织中LDH含量与正常对照组比较，模型组在坐骨神经细胞凋亡数目、LDH含量显著增加〔(428.25±21.53)vs (176.37±14.15)U/mg,P<0.01〕；与模型组比较，中药干预组在坐骨神经细胞凋亡数目和LDH含量显著下降〔(216.74±17.86)U/mg,P<0.01〕。见图1。

图1　TUNEL法检测坐骨神经细胞凋亡率(×200)

2.2坐骨神经组织中MDA、GSH-Px和SOD的含量与正常对照组比较，模型组大鼠坐骨神经组织中MDA含量显著增加而GSH-Px和SOD含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，中药干预组坐骨神经组织中MDA含量均显著下降而GSH-Px和SOD的含量明显增加(P<0.01)。见表1。

表1　中药干预对8-OhdG、MDA、GSH-Px及SOD的

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

2.3血清8-OhdG的含量与正常对照组比较，模型组大鼠血清8-OhdG含量显著增加(P<0.01)；与模型组比较，中药干预组血清8-OhdG的含量明显降低(P<0.01)。见表1。

3讨论

DPN是糖尿病常见的并发症之一，起病隐匿，发病率高，是糖尿病患者致残的主要原因，严重影响糖尿病患者的生存质量。因此，如何预防和治疗 DPN 是目前研究热点之一。

高糖状态诱导的坐骨神经细胞凋亡损伤是导致患者出现神经功能缺损的主要原因〔2〕。临床病理证实，DPN患者坐骨神经细胞出现典型的凋亡相关的超微结构变化，核膜破裂，染色质凝集，核碎裂分散于胞质中，形成凋亡小体；神经凋亡数目显著增加。本研究表明，在模型组中大鼠坐骨神经细胞的凋亡数目及LDH含量显著上升，给予中药糖络通干预后，坐骨神经细胞凋亡数目及LDH含量明显下降，表明糖络通能有效抑制DPN坐骨神经细胞凋亡，具有显著的神经细胞保护作用。

脂质过氧化产物的稳定代谢物MDA的含量可反映组织自由基的含量和脂质过氧化程度；8-OhdG是由ROS中羟自由基进攻脱氧鸟苷8位碳原子而形成的。MDA与8-OhdG被认为是DNA氧化损伤标志物，是评价机体氧化应激状态的敏感指标。临床与基础研究证实，体内的在高血糖条件下，活性氧簇生成增多，过量的自由基通过攻击膜蛋白质、核酸及生物膜上的不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，致使细胞结构和功能遭到破坏，诱导神经细胞凋亡坏死〔3，4〕。本研究提示在DPN发病过程中，氧化应激是导致神经细胞损伤凋亡的主要发病机制。SOD是生物体内至关重要的氧自由基清除剂；GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，体内SOD与GSH-Px的高低可反映机体清除自由基的能力，也是机体重要的抗氧化防御机制。本研究证实，糖络通可以有效上调SOD及GSH-Px的表达，减轻坐骨神经细胞的凋亡和损伤。

本实验推测糖络通治疗DPN变是通过上调GSH-Px和SOD的表达，减轻坐骨神经细胞的氧化损伤，来延缓DPN的发生与发展。

参考文献4

1Kamei J，Ohhashi Y，Aoki T，etal.Streptozotocin-induced diabetes in mice reduces the nociceptive threhold，as recognized after application of noxious mechanical stimuti but not of thermal stimuli〔J〕.Pharmacol Biochem Behav，1991；39(2)：541-4.

2Wu YB，Shi LL，Wu YJ，etal.Protective effect of gliclazide on diabetic peripheral neuropathy through Drp-1 mediated-oxidative stress and apoptosis〔J〕.Neurosci Lett，2012；523(1)：45-9.

3Kellogg AP，Cheng HT，Pop-Busui R.Cyclooxygenase-2 pathway as a potential therapeutic target in diabetic peripheral neuropathy〔J〕.Curr Drug Targets，2008；9(1)：68-76.

4Sima AA.Pathological mechanisms involved in diabetic neuropathy：can we slow the process〔J〕?Curr Opin Invest Drugs,2006；7(4)：324-37.

〔2014-03-21修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：韩杰(1966-)，男，医学博士，教授，硕士生导师，主要从事神经系统疾病的临床与基础研究。

中图分类号〔〕R285.5〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6072-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.029