铁引起认知相关缺损的机制及干预

刘国生　李丹丹　郑　晗　周　维　王晓亮　郑建琼

(湖北民族学院附属民大医院医学检验科，湖北　恩施　445000)



铁引起认知相关缺损的机制及干预

刘国生李丹丹1郑晗1周维王晓亮郑建琼

(湖北民族学院附属民大医院医学检验科，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探讨老年性痴呆等神经退行性疾病患者大脑中神经元烟碱型胆碱能受体(nAchRs)的丢失是否与异常增高的脑铁有关，以及铁神经毒性的作用机制，寻求预防途径。方法建立铁致神经元损伤模型，采用TBARS，MTT,Annexin-V以及配体结合实验方法，观察PC12细胞在铁侵害早期细胞损伤的机制及抗氧化剂的保护作用。结果硫酸亚铁(FeSO4)在低浓度(1～100 μmol/L)范围引起细胞膜脂质过氧化和细胞毒性作用呈剂量依赖性增加，但不引起明显可见的凋亡和坏死。与对照组比较，该浓度范围可引起〔125I〕 α-Bungarotoxin结合位点明显减少，但预先用抗氧化剂处理，可阻止铁对〔125I〕 α-Bungarotoxin的亲和力。结论铁诱导氧化应激，能降低〔125I〕 α-Bungarotoxin结合位点数量，这些改变发生在PC12细胞损害早期阶段。铁与氧化应激对nAchRs的损伤可早于凋亡和坏死的过程，可能发生在神经退行性病程的早期。直接降低脑铁浓度及抑制活性氧化物质的产生应是预防和治疗认知缺损相关神经退行性疾病的一个方向。

关键词〔〕烟碱型胆碱能；老年性痴呆；铁氧化应激

1湖北民族学院附属民大医院神经内科

第一作者：刘国生(1982-)，男，主管检验师，硕士在读，主要从事临床检验研究。

神经元烟碱型胆碱能受体(nAchRs)在大脑认知功能中起主要作用〔1,2〕。值得注意的是在一些中枢神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD),帕金森病(PD)和精神分裂症患者中nAchRs功能缺乏，含nAchRs的神经元大量丢失是这些疾病的主要病因之一，尤其是AD其临床表现主要为记忆力进行性减退和认知功能障碍，中枢胆碱能系统功能减退发生最早，最明显〔3〕。但迄今为止nAchRs缺失的病因和发病机制，仍不清楚。近年来研究表明，脑铁代谢异常，可引起许多脑部疾病。在AD、PD患者脑内的基底神经节和老年斑中，铁含量异常增高,并存在氧化应激状态〔4,5〕。脑部铁浓度升高可导致铁氧化应激和抗氧化保护机制的缺失，可能是神经元变性死亡的原因之一。但关于铁对nAchRs毒性作用的研究，在国内尚未见报道。本研究利用铁作为诱导剂直接观察早期神经元损伤机制，以及抗氧化剂对神经元的保护作用。

1材料与方法

1.1材料MTT、(sigma公司)、硫巴比妥酸，硫酸亚铁、维生素E(VitE)、还原型谷胱甘肽(GSH)购于上海第六制药厂。Annexin-V-Fluos 染色试剂盒购于(Boehringer-Mannheim,德国)。

1.2细胞培养PC12细胞生长在含RPMI1640培养液，含2 mmol/L谷维素、10%灭活马血清、5%小牛血清和2.5 μ/ml青-链霉素、培养皿预先涂有鼠尾胶，细胞培养皿置于37℃含5%CO2湿气培养箱中。

1.3抗氧化保护实验10 mmol/L硫酸亚铁(FeSO4)储备液含0.5% H2SO4维持溶液Fe2+状态〔6〕。分别加入不同浓度FeSO4诱导处理PC12细胞脂质过氧化96 h。培养细胞预先用20 mmol/L VitE或2 mmol/L GSH处理细胞后，暴露于100 μmol/L FeSO4孵育96 h。

1.4硫代巴比妥酸反应物(TBARS)检测用硫巴比妥酸反应物检测分析法〔7〕检测培养液中丙二醛(MDA)含量。细胞并离心收集上清加入三氯醋酸(TCA)至4.5% TCA的混合，然后，加入两体积的TBARS试剂(含0.45%TCA和12%醋酸)混合后，在90℃温度孵育60 min，用波长532 nm的光谱仪，检测上清液中TBARS的含量。

1.5MTT递减分析对数生长期PC12细胞铺在96孔板内细胞密度为5 000细胞/孔，加入10% 透析了的胎牛血清 ，次日换液，换入含不同铁离子浓度的培养液。连续培养96 h，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT贮存液孵育4 h后，每孔加入100 μl溶液(20%SDS和50%二甲基亚砜(pp.8)过夜，570 nm波长测得吸收率〔8〕。

1.6凋亡和坏死分析采用Annexin-V-FLUOS 染色试剂盒进行凋亡和坏死分析实验，用FeSO4处理5×105对数生长期的细胞96 h后，置于100 μl标记溶液，内含1 μl Annexin-V(标记凋亡)和1 μl PI标记坏死。室温下，孵育15 min，随机性对照。但加入2 μmol/L Staurosporine孵育3 h诱导凋亡〔3〕，细胞用FACScan 流式细胞仪进行分析。

1.7〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)配体结合实验〔125I〕 α-BTX(260 Ci/mmol)结合实验。粗膜制备，离心，取上清测定其蛋白含量，粗膜混悬液(100 μg)与2 nmol/L〔125I〕 α-BTX，25℃共同孵育30 min。清洗、离心，微管底部沉淀物在COBRA γ计数器计数(Packard Instrument,Meridian,CT)。另加入1 μmol/L放射性核素未标记的α-BTX，确定非特异性结合力。

1.8统计学分析应用SPSS10.0软件行t检验。

2结果

2.1TBARS变化加入不同浓度(10～1 000 μmol/L)FeSO4与PC12细胞共同孵育96 h后，TBARS量呈浓度依赖性递增。见表1。

2.2细胞活性和神经细胞毒性测定FeSO4处理96 h后，细胞活性明显下降，随FeSO4浓度呈依赖性递减20%～80%。见表1。

2.3自由基诱导剂导致培养细胞凋亡或坏死的浓度测定将PC12细胞分别用不同浓度的FeSO4处理PC12细胞，当FeSO4浓度低于200 μmol/L时，未检测出凋亡细胞，而当细胞暴露在高浓度500～1 000 μmol/L的FeSO4时，出现凋亡细胞(表2)。自由基诱导剂引起细胞坏死，结果也与上述情况相同(表2)。Staurosporine已证明为凋亡诱导剂〔9〕。在本研究中作为阳性对照。2 μmol/L Staurosporine处理PC12细胞3 h，明确诱导细胞凋亡而不是坏死，也无脂质过氧化，为一个可靠的检测PC12细胞凋亡的方法。

表1　不同浓度FeSO4作用后的

表2　不同浓度FeSO4作用后细胞凋亡或坏死浓度的变化(%)

2.4FeSO4诱导PC12细胞损害早期〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)结合位点的变化与对照组(27.01 fmol/mg)比较，100 μmol/L FeSO4处理后的PC12细胞其〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)结合位点下降33%(18.11 fmol/mg,P<0.05),1 μmol/L FeSO4和10 μmol/L FeSO4处理组分别下降6%(25.39 fmol/ml)和15%(22.96 fmol/mg)，但与对照组相比无显著差异P>0.05〕，而单独用VitE和GSH处理PC12细胞，其〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)结合力未见改变(资料未提供)然而，预先用VitE和GSH分别处理PC12细胞可以干预其诱导的〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)结合位点的下调，其中对照组结合焦点为27.01 fmol/mg，单独FeSO4结合位点为14.03 fmol/mg，预先Vit E、GSH分别处理后为25.61、22.76 fmol/mg。

3讨论

脑组织是体内氧负荷最大的器官，氧化应激、自由基产生和抗氧化防御系统失衡是导致AD、PD的原因之一。

铁的致氧化损伤作用愈来愈引起人们的关注。正常情况铁分布于整个脑组织中，但其分布不均匀。基底神经节中含量最高并随年龄增加，对脑组织功能活动极为重要。铁是电子传递者，是线粒体氧化和氧运输不可缺少的物质，脑铁代谢平衡对维持正常脑功能尤其是认知功能必不可少。近年来研究显示AD等基底神经节疾病铁沉积增多,脑组织氧化损伤程度与局部脑铁直接相关〔10〕，这种脑铁的增加是否是疾病的起因,一直未有定论。

本研究表明细胞膜对铁的致氧化损伤十分敏感,与有关脑铁代谢紊乱是一些中枢退行性疾病的始发因素的观点一致。通过与过氧化氢和氧的反应，游离铁可引发脂质过氧化和细胞膜的损伤最终导致细胞死亡〔6〕。MDA水平反映细胞膜脂质过氧化程度，本研究条件下，培养的细胞暴露在10～100 μmol/L FeSO4中96 h，MDA水平是浓度依赖性递增，MTT分析细胞死亡率亦呈浓度依赖性递减。

在PC12细胞MTT降解率下降是自由基诱导损害的一个早期特异性指征〔7〕。细胞死亡经由凋亡或坏死，细胞膜磷脂倒置是鉴别神经元凋亡初期的改变〔8〕。本研究结果表明游离铁暴露致细胞膜磷脂发生倒置，但只有较高浓度的铁离子(500～1 000 μmol/L)才引起细胞早期凋亡与Kruman等〔8〕结果一致，500 μmol/L以上才出现细胞坏死。与凋亡、坏死相比，PC12细胞暴露较低浓度(1～200 μmol/L)FeSO4也能引起MTT下降，表明MTT分析可作为检测早于凋亡、坏死发生之前细胞损害的敏感性指标。更重要的是，它可作为自由基损害nAchRs早期相对特异性的改变，而不是晚期的死亡，由此，揭示了氧自由基引起nAchRs缺损的一个可能机制〔11〕。因此，本研究用低浓度自由基诱导剂FeSO4处理细胞，早在细胞发生凋亡、坏死之前，观察铁对nAchRs的损害机制。

细胞膜脂质过氧化将导致膜完整性破坏，多不饱和脂肪酸链对于维持细胞膜的流动性是必不可少的，而这些脂肪酸过氧化将增加细胞膜的僵硬程度，由此降低膜受体的活动度。而脑中受体周围脂质环境可能对自由基更敏感〔12〕。本实验结果显示培养的PC12 细胞的〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)和〔3H〕epibatidine结合力下降是由于脂质过氧化环境引起的nAchRs受体早期损害，而不是濒死细胞的最终结果。如果预先用抗氧化剂处理，可抑制结合位点数量的降低，进一步支持这一观点。在AD病人脑中N受体的缺损近来引起愈来愈多的关注，α7亚单位在海马、皮质高密度分布，它们能够形成同源性单聚体型烟碱受体亚型，明显参与几种学习记忆行为〔13〕。

因脑组织中氧利用率高，细胞膜含有丰富的对氧自由基敏感的多聚不饱和脂肪酸，更易遭受自由基介导的损害。与正常衰老组织比较，AD患者脑中海马、杏仁核、Maynert基底核以及大脑皮层中铁水平升高，脑组织中自由基产生也增加，而在AD大脑中，nAchRs的大量缺失主要发生在基底前脑、皮质、海马。有资料证明抗氧化剂，如Vit E 可保护神经元免受氧自由基的损害，减缓AD病程〔14〕。本研究结果同样也证实Vit E和还原型谷胱甘肽可保护铁诱导的nAchRs的缺损，由此提示，铁自由基对细胞膜的攻击可能是nAchRs缺损的一个机制。尽管氧化应激不是特定因素，但可能是nAchRs结构功能改变的主要原因。进一步探讨铁对脑的功能影响的可能途径及抗氧化剂的干预作用是今后研究AD等神经退行性疾病的一个方向。

参考文献4

1卢家红，吕传真，王亮，等.α7烟碱型乙酰胆碱受体在阿尔茨海默病患者脑中的沉积及与Aβ-(1-42)的关系〔J〕.中华神经科杂志,2004;37(5):389.

2车鹏，田建英.α7烟碱型乙酰胆碱受体相关疾病及其研究进展〔J〕.宁夏医科大学学报，2010;32(2)：308-11.

3蒲亚岚，李永红. 阿尔茨海默病中枢胆碱能系统的损伤及主要机制〔J〕.中国老年学杂志， 2010；30(24):3840-2.

4王林，史继新.铁的生物特性在神经变性疾病中的作用〔J〕.中国临床康复，2004;8(13)：2596-7.

5姜宏，陈文芳，谢俊霞. 帕金森氏综合症模型大鼠脑内多巴胺与铁含量的关系〔J〕.生理学报，2001;53(5)：334-8.

6Enster L.Lipid peroxidation inbiological membranes:mechanisms and implications. In:Yagi K,editor. Active oxygens,lipid peroxidates,and antioxidants〔M〕. Tokyo:Japan Science Society Press,1993:1-38.

7Rimon G,Bazenet CE,Rubbin LL,etal.Increased surface phosphatidylserine is an early marker of neuronal apoptosis〔J〕.Neurosci Res， 1997；48(6):63-70.

8Kruman I,Guo Q,Mattson MP.Calcium and reactive oxygen species mediate staurosporine-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis in PC12 cells〔J〕.Neurosci Res， 1998；51(3):293-308.

9魏艳，谢兆红，许继平，等. 阿尔茨海默病生物标记物的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(15):563-70.

10Mancuso M，Orsucci D，Siciliano G，etal.Mitochondria，mitochondrial DNA and Alzheimer’s disease．What comes first〔J〕.Curr Alzheimer Res，2008；5(5)：457-68．

11武福军，詹永乐，朱飞奇，等. 线粒体变化机制与阿尔茨海默病〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(2):354-6.

12Hellstrom-Lindahl E,Ravid R,Nordberg A,etal.Regional distribution of nicotinic subunit mRNAs in human brain:comparison between Alzheimer and normal brain〔J〕.Brain Res Mol Brain Res,1999;66(4):94-103.

13Meyer EM,Fiebre CM. 3-〔2,4-Dimethoxybenzylidene〕 anabasine(DMXB)selsctively activates rat alpha7 receptors and improve memory-related behaviors in a mecamylamine-sensitive manner〔J〕.Brain Res,1997;768(10):49-56.

14Sano M,Thal LJ,Ernesto C,etal.A controlled trial of selegiline,alpha-topopherol,Or both as treatment for Alzheimer disease. The Alzheimer disease cooperative study〔J〕.N Engl J Med,1997;336(17):1216-22.

〔2014-06-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：李丹丹(1987-)，女，护师，主要从事临床神经退行性疾病护理研究。

中图分类号〔〕R749〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6070-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.028