针刺四神聪、百会对失眠大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质表达的影响

2016-01-28刘振华王世军

中国老年学杂志 2015年21期

关键词：失眠针刺

刘振华　王世军

(山东大学附属省立医院神经内科　山东省睡眠医学中心，山东　济南　250021)

针刺四神聪、百会对失眠大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质表达的影响

刘振华王世军1

(山东大学附属省立医院神经内科山东省睡眠医学中心，山东济南250021)

摘要〔〕目的探究针刺四神聪、百会对失眠大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质表达的影响。方法成年Wistar大鼠50只，随机分为手针组、电针组、阳性药组、模型组及对照组，每组各10只。采用弱碱性生理盐水配置成混悬液的氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射建立失眠模型，按45 mg/100 g的用量，1次/d，连续2 d，造模成功后，手针组大鼠固定，用规格为30号的1寸毫针针刺百会及四神聪穴，平补平泻，15 min行针1次，共留针30 min。电针组取相同穴位，给予电针刺激，电压为9 V，选择疏密波，以实验大鼠头部轻摆动为度，共30 min。连续7 d。阳性药组腹腔注射地西泮0.9 mg/kg，1次/d。模型组及对照组大鼠不给予任何实验措施，均连续7 d。干预结束后PCR法检测大鼠的钟基因表达，离子色谱仪检测下丘脑Glu、GABA水平，HE染色观察下丘脑形态学改变。结果治疗后，治疗各组大鼠的钟基因相关指标表达水平均明显改善，与模型组相比差异显著(P<0.05)；与手针组相比，电针组钟基因各指标改善更为明显(P>0.05)；(1)治疗后，治疗各组大鼠的下丘脑Glu、GABA水平明显改善，与模型组相比差异显著(P>0.05)；与手针组相比，电针组的下丘脑Glu、GABA水平改善更为显著(P<0.05)。(2)对照组大鼠下丘脑神经细胞丰富，各种细胞均清晰可见，且均匀分布，细胞结构完整，排列紧密；模型组大鼠下丘脑细胞形变严重，大量细胞空泡，排列疏松，细胞界限模糊；治疗各组可见丘脑核团细胞大量恢复，细胞排列较整齐，细胞空泡明显减少，偶见萎缩细胞，其中电针组下丘脑细胞恢复更为显著。结论针刺四神聪、百会能够明显改善失眠大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质表达水平，对临床有指导意义。

关键词〔〕针刺；失眠；钟基因；氨基酸类神经递质

1山东中医药大学中西医结合基础学院

第一作者：刘振华(1964-)，男，博士，主任医师，主要从事脑血管病、睡眠障碍、癫痫研究。

失眠(SD)是指入睡障碍和睡眠维持障碍，又称为睡眠障碍，SD患者睡眠质量较差，无法满足个体生理需要，从而影响白天活动的一种睡眠障碍综合征〔1〕。难于入睡和睡眠维持困难是其主要特点，长期失眠会严重影响工作生活，还可诱发心、脑等疾病，甚至导致心理疾病，严重者还可引发自杀倾向和意外事故等〔2〕。中医称SD为“不寐”、“不得卧”、“不得眠”等，主要是由于脏腑功能失调，阴阳失衡、气血瘀阻而无法获得正常睡眠。SD的主要病因病机是“阳不入阴，阴阳失调”，故其主要治则为调和阴阳，中医根据辨证论治，通过“补虚泻实”手段以达到“阴平阳秘，精神乃治”的目的〔3〕。针灸治疗效果颇佳，其优点为安全高效、简单易行、无副作用、无依赖等，现已广泛为患者所接受〔4〕。本实验对SD大鼠行针刺干预，通过观察大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质的表达，探究针刺四神聪、百会治疗SD的疗效。

1材料与方法

1.1实验动物成年Wistar大鼠50只(广州中医药大学动物中心提供，No.0055714)，SPF级，雄性，体重200～230 g，在相同饲养条件下饲养，自然光照，40%～60%湿度，自由进食水。

1.2仪器及试剂氯苯丙氨酸(PCPA，阿法埃莎公司)、光学显微镜、冷冻离心机、血糖(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)标准品(美国Sigma公司)、G6805-2型电针仪(苏州医疗用品厂)、ICS-2500型离子色谱仪(美国戴安公司)、Trizol逆转录试剂盒、异丙醇、无水乙醇、氯仿、实时荧光定量PCR试剂盒。

1.3实验方法

1.3.1模型的建立随机选取40只大鼠，将PCPA用弱碱性生理盐水配置成混悬液，pH7～8，按45 mg/100 g的用量腹腔注射，1次/d，连续2 d，建立SD大鼠模型。其余大鼠腹腔注射2 ml生理盐水。大鼠出现活动频繁、昼夜节律混乱、兴奋性及攻击性增强、饮食及二便明显不规律，表明造模成功。

1.3.2分组和用药造模成功大鼠随机分为手针组、电针组、阳性药组、模型组，每组各10只；其余10只未建立模型大鼠为对照组。从造模成功开始，手针组大鼠固定，用规格为30号的1寸毫针针刺百会及四神聪穴。取穴参照《实验针灸学》〔5〕大鼠穴位的定位方法，四神聪穴为百会穴的前、后、左、右各旁开5 mm。向后平刺4 mm，手法为平补平泻，15 min行针1次，共留针30 min。电针组取相同穴位，取穴法同前，将大鼠固定，给予电针刺激，电压为9 V，选择疏密波，以实验大鼠头部轻摆动为度，共30 min。连续7 d。其余各组大鼠在同一时间均固定，阳性药组腹腔注射地西泮(安定)，剂量为0.9 mg/kg，1次/d。模型组及对照组大鼠不给予任何实验措施，均连续7 d。

1.4检测指标及观察方法

1.4.1PCR法检测钟基因表达水平所有大鼠于末次给药12 h后，麻醉，固定，以矢状缝为纵轴，剪开颅顶骨及硬脑膜，从联合窦下取出松果体，-80℃保存待检。将组织研碎，加入1 ml TRIzol，反复吹打混匀，加入氯仿，振荡后离心。加入异丙醇后混匀，重复离心步骤，去上清，严格按照说明书步骤进行逆转录，上样，电泳。凝胶成像系统下观察条带的情况。引物序列见表1。

表1　钟基因的引物序列

1.4.2下丘脑Glu、GABA含量的检测实验结束后各组大鼠开颅取整个脑组织，分离下丘脑，洗去血液后加入生理盐水进行匀浆，2 000 r/min离心5 min，取上清，采用离子色谱仪检测下丘脑Glu、GABA含量，并计算其比值。激发波长为340 nm，发射波长450 nm。流量：1 ml/min，柱温40℃。

1.4.3下丘脑形态学观察将各组大鼠下丘脑用甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片、染色，在光镜下观察其组织形态学变化。

1.5统计学方法应用SPSS19.0软件，计量资料采取t检验，计数资料运用χ2检验。

2结果

2.1各组大鼠钟基因水平比较治疗后，治疗各组大鼠的Clock、Bmal1、Per1基因表达水平均明显改善，与模型组相比差异显著(P<0.05)；与手针组相比，电针组钟基因各指标改善更为明显(P<0.05)；手针组与阳性药组无统计学差异(P>0.05)。见表2，图1。

表2　各组大鼠Clock、Bmal1、Per1水平比较

与模型组相比：1)P<0.05；与手针组相比：2)P<0.05；下表同

1.对照组；2.模型组；3.手针组；4.电针组；5.阳性药组图1　各组大鼠钟基因水平比较

2.2各组大鼠Glu、GABA水平比较治疗后，治疗各组大鼠下丘脑Glu水平明显降低，GABA水平明显升高，与模型组相比差异显著(P>0.05)；与手针组相比，电针组的下丘脑Glu、GABA水平改善更为显著(P<0.05)。见表3。

表3　各组大鼠下丘脑Glu、GABA水平比较

图3　各组大鼠下丘脑病理切片(HE)

2.3各组大鼠下丘脑病理切片对照组大鼠下丘脑神经细胞丰富，各种细胞均清晰可见，且均匀分布，细胞结构完整，排列紧密；模型组大鼠下丘脑细胞形变严重，大量细胞空泡，排列疏松，细胞界限模糊；治疗各组可见丘脑核团细胞大量恢复，细胞排列较整齐，细胞空泡明显减少，偶见萎缩细胞，其中电针组下丘脑细胞恢复更为显著。见图3。3讨论

睡眠是维持正常人身体健康、机体复原、巩固记忆的重要过程。正常人生命三分之一的时间处在睡眠过程，因此睡眠是人的生理过程中必不可少的组成部分。失眠又称睡眠障碍，严重威胁身体健康和日常生活、工作。我国睡眠研究会最新的流行病学调查统计显示，我国成年人的SB发生率高达38.2%〔6〕。祖国医学采用针刺治疗SB，具有操作简便、疗效突出且副作用小的特点〔7〕。本实验结果表明，针刺四神聪、百会能够明显改善SB大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质表达水平，抑制SB症状的发生和发展，对临床有指导意义。

有研究表明〔8〕，调控生物节律的生物钟基因与睡眠的关系密切。在自然状态下，生物钟接受外界的温度、光线等信号，调整人体以适应外界环境。目前国内外研究确认的钟基因成分包括Clock、BmalK、CryK、Cry2、Perl、Per2、Per3等，主要集中于下丘脑前部松果体。其中Clock基因控制睡眠的稳态，其突变可以导致睡眠减少和神经高度兴奋〔9〕。实验表明，SB模型大鼠的Clock基因水平明显降低。针刺可降低神经的应激功能，到达镇静的作用。本实验结果表明，针刺可调控钟基因，从而治疗；并且通过持续的穴位电流刺激能够更好地达到调控钟基因、镇静以治疗SB的作用。

睡眠与觉醒涉及复杂的神经生理过程，多种神经递质均参与其调控〔10〕。研究表明，睡眠障碍患者的中枢神经系统处于抑制状态，与中枢神经系统内的抑制性氨基酸与兴奋性氨基酸神经递质的动态平衡被打破关系密切，通常变现为前者的增多和后者的减少〔11〕。GABA、Glu的改变在睡眠的调节过程中发挥了重要作用。Glu是主要的兴奋性神经递质，含量较高，参与了有关细胞凋亡、学习和记忆的过程。在下丘脑中，几乎所有的神经元中都含有Glu受体，Glu含量升高会引起神经兴奋，从而导致SB的发生。实验结果表明，针刺能够明显降低下丘脑中的Glu含量，表明针刺能够通过调控Glu的水平，降低神经的兴奋性，从而治疗SB。GABA是一种非蛋白质性氨基酸，是重要的抑制性神经递质，对大部分的神经元均有抑制作用。研究表明〔12〕，GABA在睡眠过程发挥着重要的调节作用。另有研究表明〔13〕，在睡眠过程中大脑皮层内释放的GABA是清醒时的3倍。因此，GABA含量减少会导致SB的发生。实验结果表明，失眠大鼠经针刺干预后，GABA含量明显升高，提示针刺治疗能够明显促进神经递质对神经元的抑制作用，降低神经的兴奋性，从而抑制失眠的发生；而电针通过穴位上的持续电流刺激能够更好地达到治疗SB的效果。

综上所述，针刺四神聪、百会能够明显改善失眠大鼠脑组织钟基因及氨基酸类神经递质表达水平，对临床有指导意义。

参考文献4

1赵晓东，时晶，杨益昌，等.失眠的诊断与中西医治疗〔J〕.中华中医药杂志，2011；26(11)：2641-3.

2文建军，吴燕.灵龟八法治疗失眠 45 例疗效观察〔J〕.河北中医，2011；33(12)：1832-3.

3谌剑飞.睡眠障碍的现代病因病机探索〔J〕.中国中西医结合杂志，2012；32(2)：151-2.

4孔红兵，燕炼钢，汪瑛，等.针灸治疗失眠症 52 例临床观察〔J〕.中医药临床杂志，2012；23(12)：1040-1.

5李忠仁.实验针灸学〔M〕.北京：中国中医药出版社，2008：33-5.

6赵忠新，张照环.应给予睡眠更多的关注〔J〕.中华神经科杂志，2011；44(8)：513-5.

7李雪超.针刺“ 颅底七穴” 治疗后循环缺血性眩晕临床疗效观察〔D〕.北京：北京中医药大学硕士论文，2013.

8安怀杰，郑巍薇，史成和，等.生物钟基因 period3 的多态性及其与睡眠关系的研究进展〔J〕.山西医科大学学报，2014；45(6)：525-8.

9曹银利，崔勤涛，唐成和，等.CLOCK 基因 T3111C 多态性与儿童注意缺陷多动障碍及相关睡眠障碍的关联研究〔J〕.中国当代儿科杂志，2012；14(4)：285-8.

10乔秀英，傅平，张风华.婴儿睡眠觉醒神经生理调节机制研究进展〔J〕.中国儿童保健杂志，2012；20(9)：817-9.