miR-215对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及机制

林振吕　张　琳　郑建涛

(福建医科大学附属第一医院急诊外科，福建　福州　350005)



miR-215对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及机制

林振吕张琳郑建涛1

(福建医科大学附属第一医院急诊外科，福建福州350005)

摘要〔〕目的探讨miR-215对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及作用机制。方法通过RT-PCR检测miR-215在高转移胃癌细胞株NCI-N87，BGC-823，RF-48及低转移细胞株HGC-27及MKN-28中的表达；Transwell迁移及侵袭实验检测miR-215抑制剂对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响；Western印迹检测miR-215抑制剂对胃癌细胞活化白细胞黏附分子(ALCAM)，基质金属蛋白酶(MMP)-2，MMP-9，上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏附素(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)表达量的影响。结果RT-PCR结果证实miR-215在高转移胃癌细胞株中的表达高于低转移胃癌细胞中的表达，且miR-215在BGC-823细胞中的表达最高，因此选用BGC-823作为后续实验细胞株。miR-215抑制剂转染BGC-823细胞48 h后，发现下调miR-215表达能显著抑制BGC-823细胞迁移及侵袭能力，并能下调ALCAM，MMP-2，MMP-9及Vimentin表达，上调E-cadherin表达。结论miR-215低表达能显著抑制胃癌细胞BGC-823侵袭及转移能力，与下调MMPs及抑制EMT生成有关。

关键词〔〕miR-215；胃癌细胞；侵袭；转移

1福建医科大学附属第一医院胃肠外科

第一作者：林振吕(1968-)，男，副主任医师，主要从事普外科研究。

随着外科手术水平，生物治疗及化疗放疗手段的提高，胃癌患者的治愈率大大提高，但是5年生存率不足30%，主要原因是肿瘤组织的侵袭转移导致预后不良〔1,2〕。同时胃癌早期症状不易发现或无任何症状，因此，常导致诊断被延误。所以探索高敏感性，高特异性的肿瘤标志物，对于胃癌的诊断及肿瘤的侵袭转移机制的研究具有重要意义。大量的实验研究证实，miRNA与肿瘤的增殖，凋亡，分化，侵袭及转移密切相关，在人类肿瘤包括胃癌的发生发展中起着重要作用〔3,4〕。国内外研究发现miR-215在胃癌组织中表达异常，如Jin等〔5〕通过miRNA芯片技术及实时荧光定量-PCR证实miR-215在胃癌组织中的表达高于正常组织，且过表达miR-215可显著促进胃癌细胞HFE145迁移。李良平等〔6〕发现胃癌患者血清中miR-215的含量高于健康对照者，提示miR-215的表达与胃癌的发生或发展有关。因此本文在此基础上，进一步探讨miR-215在不同转移程度胃癌细胞株中的表达情况，从中选出miR-215表达量最高的胃癌细胞株，并探讨miR-215对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及机制。

1材料和方法

1.1细胞株人胃癌细胞株NCI-N87，BGC-823，HGC-27购于中科院上海细胞库，目录号分别为：TCHu130，TCHu11，TCHu22；RF-48，MKN-28购自上海拜力生物科技有限公司；分别培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

1.2试剂及仪器四唑盐试剂(MTT，Sigma公司)；兔抗基质金属蛋白(MMP)-2，MMP-9，E-钙黏附素(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)， 活化白细胞黏附分子(ALCAM)，GADPH抗体(Epitmics公司)；Transwell 小室(Corning 公司)；结晶紫(Sigma公司)；miR-215抑制剂，miR-215 NC(上海吉玛制药公司)。倒置显微镜(Nikon公司)；流式细胞仪(BD 公司)；迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪，ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

1.3RT-PCR检测miR-215在胃癌细胞株中的表达总RNA的提取参考Trizol试剂盒 (Invitrogen) 使用说明书，整个提取处于无RNAase的环境下。引物设计如下，miR-215上游引物：5'-CTCGAGATGTCATCCTCAG-3'，下游引物：5'GAATTCGTGAGTTCTTCTG-3'。 GAPDH作为内参标记物，上游引物：5'- AATCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物5'- CCTGCTTCAACCACCTTCTTG-3'。通过一步法RT-PCR试剂盒将RNA逆转录成cDNA并进行PCR扩增，获取 5 μl扩增产物用于下一步2%的琼脂糖胶进行检测。

1.4迁移实验将BGC-823接种于96孔板，当细胞汇合度达到50%时，转染miR-215抑制剂和对照NC，转染达到48 h后，将细胞消化加入Transwell上室，下室用含 5%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养24 h，取出Transwell小室，洗涤，多聚甲醛固定，结晶紫染色，被染色的细胞浆呈紫色，倒置光学显微镜下计数5个视野迁移细胞个数，计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的迁移能力。

1.5侵袭实验将 Matrigel 胶均匀平铺于Transwell 小室的微膜(8 μm)上，制成凝胶备用。后按1.4方法进行操作，最后倒置光学显微镜下计数5个视野穿膜细胞个数，计算平均每个视野的细胞数，即表示细胞的侵袭能力。

1.6Western印迹当细胞汇合度达到50%时，转miR-215和对应的对照NC，转染达到48 h后，转染达到48 h后，刮下细胞，离心，后加入适量的RIPA裂解液，每隔10 min置于涡旋仪中震荡30 s，40 min后，4℃，10 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。蛋白上样，跑SDS凝胶电泳，后湿法转膜。将膜浸入一抗溶液孵育，4℃过夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室温孵育1～2 h。将膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件对各抗体条带灰度值进行统计。

1.7数据分析采用SPSS17.0软件行t检验。

2结果

2.1miR-215在5株胃癌癌细胞株中的表达通过RT-PCR和检测发现miR-215在RF-48、NCI-N87、BGC-823高转移胃癌细胞株中的表达量〔(2.30±0.22)，(2.54±0.14)，(3.22±0.25)〕高于MKN-28、HGC-27低转移胃癌细胞株中的表达量〔(1.01±0.21)、(1.31±0.20)〕，且在BGC-823中miR-215表达量最高，因此作为后续实验的细胞株。

2.2miR-215抑制剂对BGC-823细胞迁移和侵袭能力的影响如图1，图2所示，抑制剂及NC转染48 h后，与NC组比较，miR-215抑制剂能显著抑制BGC-823细胞迁移能力〔(99.05%±7.43%)vs(48.32%±5.38%)〕及侵袭能力〔(99.98%±8.12%)vs(55.45%±6.07%)〕(P<0.01)。

图1　miR-215抑制剂对BGC-823细胞迁移能力的影响

图2　miR-215抑制剂对BGC-823细胞侵袭能力的影响

2.3miR-215抑制剂对BGC-823细胞中ALCAM表达量的影响如图3所示，与NC组(1.25±0.14)比较，miR-215抑制剂(0.34±0.05)能显著抑制BGC-823细胞中ALCAM的表达(P<0.01)。

图3　miR-215抑制剂对BGC-823细胞中ALCAM表达量的影响

2.4miR-215抑制剂对BGC-823细胞中MMPs表达量的影响如图4，表1所示，与NC组比较，miR-215抑制剂能显著抑制BGC-823细胞中MMP-2及MMP-9的表达(P<0.01)。

图4　miR-215抑制剂对BGC-823细胞中MMPs表达量的影响

2.5miR-215抑制剂对BGC-823细胞中E-cadherin及Vimentin表达量的影响如图5及表1示，与NC组比较，miR-215抑制剂能显著抑制BGC-823细胞中Vimentin的表达，促进E-cadherin的表达(P<0.01)。

图5　miR-215抑制剂对BGC-823细胞中E-cadherin及Vimentin表达量的影响

组别MMP2/GADPHMMP9/GADPHE-cadherinGADPHVimentin/GADPHNC组1.29±0.140.88±0.080.37±0.041.05±0.10miR-215抑制剂组0.33±0.011)0.42±0.041)0.99±0.081)0.32±0.031)

与NC组比较：1)P<0.01

3讨论

miRNAs是一类进化上高度保守的内源性非编码小分子RNA，由21～23个氨基酸组成，它能够结合于靶基因mRNA的3'-UTR区域，阻遏靶基因的翻译，从而调控靶基因表达，参与多种疾病的病理生理过程。miR-215定位于人染色体1q41，在胃癌组织或血清中高表达，并通过调节靶基因的表达水平影响胃癌细胞的增殖迁移能力〔5〕。因此本研究在此基础上，通过RT-PCR进一步检测miR-215在不同转移程度胃癌细胞株中的表达，结果发现高转移胃癌细胞株中miR-215的表达高于低转移程度胃癌细胞株，且下调miR-215能显著的抑制BGC-823细胞的迁移侵袭能力，但具体机制未知。而先前Jin等〔5〕，周志威等〔7〕的研究报道证实ALCAM是miR-215的靶分子之一，且ALCAM在胃癌组织中表达异常。ALCAM是一种广泛存在于人体各组织器官中的糖蛋白，能通过介导同嗜性黏附或异嗜性作用介导细胞间的黏附，从而影响细胞运动状态。细胞的运动性增加可显著促进肿瘤的侵袭转移。因此，通过下调ALCAM的表达量能一定程度上的抑制肿瘤细胞的迁移。

同时细胞外基质的降解是肿瘤侵袭和转移的必要步骤，MMPs是降解细胞外基质的最重要的蛋白水解酶，在细胞肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。MMP-2不仅可以降解细胞外基质中的明胶Ⅳ型胶原等，有利于肿瘤细胞沿着受损的基底膜向周围浸润，还可以通过新生毛细血管促进肿瘤的侵袭及转移，是恶性肿瘤浸润和侵袭的标志〔8〕。MMP-9是由多种细胞分泌的一种蛋白水解酶，是MMPs中分子量最大的酶，能够降解细胞外基质和基底膜，从而增加细胞的运动能力，促进肿瘤的扩散和转移。MMPs在肿瘤细胞的侵袭过程中起到至关重要的影响。陈进等〔9〕发现MMP-2在胃癌组织中的表达率为75%，MMP-9在胃癌组织中的表达率为68.3%，均显著高于周围正常组织。孙述臣等〔10〕通过Northern印迹原位分子杂交ISH法证实胃癌组织中MMP2及MMP-9 mRNA的表达水平高于正常组织。临床研究Meta分析也指出，MMP-9的高表达能够增加胃癌组织的侵袭性，影响胃癌患者的预后〔11〕。因此通过下调胃癌细胞中MMPs的表达，能显著抑制癌细胞的侵袭能力。

上皮细胞-间充质转化(EMT)最早在胚胎发育过程中得到证实，越来越多的证据表明EMT对肿瘤发生，包括局部浸润和通过循环系统转移和扩散起着重要作用，是侵袭能力最强的肿瘤细胞的特性，并且在恶性肿瘤细胞发生EMT时，可视为浸润转移的开始〔12,13〕。EMT的分子标志性特征为细胞间黏附分子E-cadherin的表达下调，一系列间充质标记物的表达上调，包括N-cadherin，Vimentin和纤连蛋白。李德艳等〔14〕发现胃癌组织中E-cadherin表达阳性率为33.33%，明显低于正常胃癌组织。熊德明等〔15〕证实Vimentin在胃癌组织中的阳性表达明显高于正常组织，且与淋巴结转移密切相关，可能参与了EMT，在胃癌转移过程起重要作用。因此通过抑制EMT的生成，也能显著的抑制胃癌细胞的侵袭转移能力。

本研究说明miR-215抑制剂可通过下调ALCAM及MMPs表达来抑制BGC-823细胞的迁移侵袭能力，显著抑制EMT的生成，与上调E-cadherin表达，下调Vimentin表达有关。

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〔2014-05-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：郑建涛(1967-)，男，副主任医师，主要从事胃肠癌诊治及基础研究。

中图分类号〔〕R73〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6064-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.026