大鼠急性心肌梗死模型的建立

杨文慧　郭　涛　杨　莉　华宝桐　刘　娟

(昆明医科大学附属延安医院老年病科，云南　昆明　650051)



大鼠急性心肌梗死模型的建立

杨文慧郭涛1杨莉华宝桐1刘娟2

(昆明医科大学附属延安医院老年病科，云南昆明650051)

摘要〔〕目的探讨建立一种能模拟临床心肌梗死事件及其病理生理变化的动物模型。方法SD大鼠麻醉后，经口插管连接小动物呼吸机，开胸高位结扎冠状动脉左前降支。术后1 w超声检测大鼠心功能，TTC染色测量心肌梗死面积，评价模型制作效果。结果手术成功率为100%，术后1 w动物存活率为90.9%。术后1 w超声检查见大鼠LVEDS、LVEDD较术前扩大，LVFS较术前降低(P<0.05)。大体见缺血区心室壁变薄塌陷。TTC染色测算梗死面积占左室面积的百分比为 35.80%±4.32%。结论本文成功建立大鼠心肌梗死模型。该模型成功率高、心肌梗死面积稳定，可运用于心肌缺血、心力衰竭、心肌重构的发病机制和治疗方法研究。

关键词〔〕动物模型；心肌梗死

1昆明医科大学第一附属医院心内科

2昆明医科大学第二附属医院心内科

第一作者：杨文慧(1982-)，女，在读博士，主治医师，主要从事冠心病、心律失常的基础及临床研究。

心肌梗死是冠心病最严重的类型〔1～3〕，深入认识其发病机制并预防它的发生、改善心肌梗死患者的预后一直是研究的重点。为此，需要建立稳定的动物模型来模拟人体发生心肌梗死的病理生理过程，并在此基础上开展研究。因模型制作过程中进行麻醉、呼吸机使用、手术操作以及心肌梗死病变本身的病理特点，导致造模的成功率低、动物术后存活时间较短、模型平行性差等问题，不利于后续的研究。本研究采用开胸高位结扎大鼠左冠前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，旨在为进一步的研究提供稳定可信的动物模型。

1材料与方法

1.1动物7周龄雄性SD大鼠55只，体重230～290 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供〔SCXK(湘)2013-0004〕。

1.2主要试剂氯化三苯基四氮唑(TTC)：美国Sigma公司(批号：101060270)；异氟烷：上海雅培制药有限公司(批号：685632U)；乌拉坦注射液；4%甲醛溶液。

1.3主要仪器小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司制造，ALC-V9型)，心脏超声仪(GE Vivid E9)；SHA-B水浴恒温振荡器(上海比朗仪器有限公司)；手术器械若干。

1.4模型制作

1.4.1麻醉及气管插管术前禁食、水12 h。9%乌拉坦按照1 ml/100 g剂量进行腹腔注射麻醉〔4〕。注射前回抽针管，以确定没有刺入血管中。大鼠麻醉后，用皮筋挂住大鼠的门齿及四肢，将大鼠仰卧位固定于180 mm×250 mm自制木板上。手术灯探照大鼠颈部，用纱布包裹大鼠舌并向外向上牵拉，可清晰观察到声门，用18 G 38 mm笔筒型静脉留置针经口插入大鼠气管插管，连接小动物呼吸机。观察大鼠的呼吸频率与呼吸机一致，确认气管插管成功后用胶布固定。呼吸机参数设定为：呼吸频率75次/min，吸呼比1∶1，潮气量13 cc。

1.4.2冠脉结扎大鼠胸部去毛，消毒手术区域，沿胸骨左缘剪开皮肤，钝性分离肌肉，剪断第3、4肋骨，暴露胸腔。用小动物开胸器撑开胸廓，拉出胸腺并固定。小心剪开心包膜暴露心脏，以肺动脉圆锥与左心耳交界处找到左前降支，在左心耳下方1～2 mm处与肺动脉圆锥间用5-0号线缝合〔5〕。进针深度1～1.5 mm，约缝合5 mm宽心肌，以保证结扎住动脉〔6〕。以心尖处变苍白为结扎成功标志。清除胸腔内残存积血。

1.4.3关闭胸腔及围术期护理检查无出血后，用0号线连续缝合肋骨。关闭胸腔之前用5 ml针筒连接套管针负压吸引胸腔内空气及残留渗血，同时挤压胸壁。然后逐层缝合肌肉、皮肤。约5 min后先松开呼吸机接口，观察到大鼠自主呼吸恢复再拔出气管插管。观察大鼠呼吸情况，若呼吸道分泌物过多或者有舌后坠应及时处理。术中及术后麻醉未苏醒前可用烤灯照射，保持动物体温，利于术后恢复。

1.5模型鉴定

1.5.1心脏功能评价造模后1 w行心脏超声检查。异氟烷吸入麻醉大鼠，心前区备皮，仰卧位固定。心前区涂抹耦合剂，使用GE Vivid E9彩色超声仪、9L-D高频探头(频率10.0 MHz)，在二维超声引导下运用M型超声经胸骨旁左室长轴切面，观察室壁运动情况，测量左室收缩末内径(LVEDS)、左室舒张末期内径(LVEDD)和左室短轴缩短率(LVFS)，取3个心动周期的平均值。

1.5.2大体病理造模后1 w处死大鼠，迅速取出心脏，置于预冷生理盐水中洗去血液，剔除心房、右心室及筋膜组织。余左心室组织置-20℃冰箱中2 min，取出后沿横切面将左室心肌均匀切成1 mm薄片。将切片放入37℃预热过的1%TTC溶液中，置于水浴恒温振荡器中，37℃振荡染色10～15 min，用4%甲醛液固定24 h，观察染色结果。非梗死心肌组织为红色，缺血坏死心肌组织为苍白色〔7〕。将染色的心肌切片置于生理盐水中，用直尺设定好标尺后照相，用Imagepro-Plus图像处理软件分析测量缺血面积，计算缺血面积占左心室面积百分比。

1.6统计学方法应用SPSS13.0软件行t检验。

2结果

2.1手术存活率55只大鼠均完成急性心肌梗死模型制作，手术成功率为100%。其中，1只因麻醉时挣扎，导致趾甲断裂、甲床出血；1只因咬伤舌头至舌出血，给予包扎止血后仍于术后当天死亡。另有3只大鼠在手术第2天死亡，考虑可能与心力衰竭有关。术后1 w有50只心肌梗死模型大鼠存活，存活率为90.9%。

2.2超声心动图检查术后1 w超声检查可见左心室前间隔运动减弱，左心室扩大，左室短轴缩短率降低。见表1。

表1　冠脉结扎前后超声检查大鼠心功能改变±s)

与术前比较：1)P<0.01

2.3大鼠心肌组织TTC染色造模后1 w处死大鼠取出心脏观察，大鼠心脏出现左室壁变薄，局部塌陷，表面颜色灰暗。TTC染色后观察到，非梗死心肌组织为红色，缺血坏死心肌组织为苍白色。测量计算梗死面积占左室面积的百分比为 35.80%±4.32%。

3讨论

目前，广泛采用结扎大鼠冠脉左前降支的方法制作心肌梗死模型。有学者采用导丝逆行牵拉气管插管的方法制作20只大鼠心梗模型，手术成功率95%，1 w存活率为90%〔8〕。另有研究进行了10只大鼠心梗模型制作，4 w存活率仅60%〔9〕。本研究术后1 w存活率均高于上述报道。与以往大鼠心肌梗死模型相比，本文采用静脉留置针管经口插管进行机械通气，保障手术安全同时最大限度减小大鼠损伤；采用剪开肋骨方法暴露手术视野，避免过度挤压牵拉心脏及大血管，同时使手术视野清晰易于操作；高位结扎大鼠冠脉左前降支，使心肌梗死部位及面积相对固定，模型平行性好。

3.1模型动物的选择当通过结扎等方法使冠状动脉急性闭塞制造急性心肌梗死的动物模型时，犬类等自身侧支循环丰富的动物一般不宜选用。这些动物由于自身原有的侧支血管丰富，冠状动脉急性闭塞后侧支循环迅速开放，很少形成大面积的心肌梗死，难以达到研究的要求。猪等大型动物的经济投入较大，手术操作的难度大，对实验设备要求高。而小鼠体型较小，需要在显微镜下进行操作，对术者的要求较高。相比之下，采用大鼠制备心脏疾病的模型具有较多优势〔10〕。大鼠容易饲养，术后管理较容易。单人就能模型制作，对实验仪器要求不高，便于实验的开展。大鼠的品系比较纯正，动物组内差异较少，在基因组学和蛋白质组学研究中具有更多的优势。同时，大鼠的冠脉系统侧支循环比较少，结扎后容易出现较固定的缺血区，使心肌梗死的模型制作更加稳定。

3.2麻醉方式大鼠麻醉的给药方式腹腔注射麻醉和吸入麻醉。熟练的术者完成一例大鼠急性心肌梗死模型的制作约需20 min，期间需保证大鼠绝对安静。吸入麻醉可控制麻醉深度及复苏时间，但需配备有吸入式小动物麻醉机，实验成本较高。腹腔注射麻醉维持时间较长，能满足模型制作的要求。乌拉坦、戊巴比妥钠、水合氯醛等都是常用的大鼠腹腔麻醉药物，本实验采用乌拉坦腹腔注射麻醉取得较好效果。

3.3气道建立大鼠气管插管比较常见的是气管切开插管和经口插管。气管切开插管对大鼠损伤较大，手术操作时间延长，缝合不当可能导致气管狭窄，也可能出现气道分泌物和血液堵塞气道。由于大鼠的声门较小，术者不易看清楚声门的位置，因此本实验中用纱布包裹后将大鼠舌头提起，手术灯照射大鼠颈部，此时可清晰观察到大鼠声门。术者用柔软的静脉留置针管进行经口插管，不易损伤大鼠口咽及气道黏膜，同时一次成功率高，避免反复插管引起黏膜水肿导致手术失败。

3.4手术开胸手术开胸有沿肋间隙进胸和切开肋骨进胸等方式。文献报道在第2肋间隙进胸获得满意的效果〔11〕。但是大鼠心脏体积较小，且心率较快，充分暴露手术视野方可保证冠脉结扎的成功率。因此，在本实验中我们切开第3、4肋骨进胸，小动物开胸器扩开胸廓，固定胸腺，能充分保证手术视野清晰，易于术者操作。术后仔细止血，逐层关胸，并用套管针连接针筒抽吸胸腔内残余气体，术后大鼠的恢复较好。

3.5冠脉结扎定位大鼠冠脉左前降支由左冠状动脉主干分出，行于动脉圆锥和左心耳之间，然后向右下行于前室间沟内。左冠状动脉主干和前降支起始端与伴行静脉的关系极为密切，高位结扎很易成功，低位结扎因动静脉关系不恒定，较不易成功〔12〕。本研究在左心耳下方1～2 mm处结扎左前降支，结扎后即可观察到心尖部心肌变为苍白色，术后超声及病理检查确认模型制作成功，心肌梗死面积稳定。大鼠冠状动脉主干及其主要分支均位于浅层心肌内，活体不易辨认，而其伴行静脉为肉眼可见的白色细小线条，因此，复制心肌梗死模型结扎动脉时，以伴行的静脉为标志。

综上所述，结扎大鼠左冠状动脉前降支复制的心肌梗死模型与心肌梗死实际发病过程比较符合，其梗死分布范围相对一致，病理生理改变与临床心肌梗死相似，是目前被广泛采用的造模方法。按照本实验操作方法可顺利完成多只大鼠急性心肌梗死模型的制备，术后经超声大体观察和TTC染色病理观察确认模型制作成功。该方法成功率高、模型稳定，可为心脏疾病相关研究提供可靠的大鼠模型。

参考文献4

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11Fu YH，Lin QX，Li XH，etal.A novel rat model of chronic heart failure following myocardial infarction〔J〕.Method Find Exp Clin Pharmacol，2009;31(6)：367-73.

12Xu Z，Alloush J，Beck E，etal.A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery〔J〕.J Vis Exp，2014;23(86):1131-5.

〔2015-05-11修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：郭涛(1957-)，男，教授，博士生导师，主要从事冠心病、心律失常的基础及临床研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260027)；云南省应用基础研究项目(2014FZ051)

中图分类号〔〕R541.4〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6019-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.007