脑脉通对大鼠骨髓间充质干细胞移植保护脑缺血微血管完整性作用的影响

刘　轲　李建生　刘敬霞　孙　捷　赵跃武　李　宁　苏　静　郭晓燕

(河南中医学院第一附属医院，河南　郑州　450006)



脑脉通对大鼠骨髓间充质干细胞移植保护脑缺血微血管完整性作用的影响

刘轲李建生1刘敬霞2孙捷1赵跃武3李宁1苏静1郭晓燕1

(河南中医学院第一附属医院，河南郑州450006)

摘要〔〕目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑缺血再灌注损伤脑微血管完整性的保护作用以及脑脉通颗粒对其的影响。方法体外培养和扩增BMSCs；大鼠随机分为假手术组、模型组、移植组、脑脉通组、联合组；线栓法制备MCAO模型；术后24 h将BMSCs由同侧颈内动脉移植脑内；光镜下观察BMSCs移植脑内7、14和28 d脑微血管病理改变，免疫组化法测定脑组织IgG和微血管基底膜ColⅣ及LN的表达。结果模型组大鼠IgG表达显著增强(P<0.01)；与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点、移植组14 d和28 d的IgG表达均显著减弱(P<0.01)；联合组较移植组7 d和28 d、较脑脉通组14 d和28 d的表达均减弱(P<0.01)。各模型组ColⅣ和LN表达减弱(P<0.01)；与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点、移植组14 d和28 d的ColⅣ和LN表达均增(P<0.01)；联合组较各移植组、14 d和28 d脑脉通组ColⅣ和LN表达均较显著增强(P<0.01)。结论脑缺血再灌注损伤引起微血管基底膜层连蛋白和胶原降解明显，血脑屏障通透性增强；BMSCs移植后早期(7 d)保护微血管受损的作用不明显，中期(14 d)和后期(28 d)用随移植脑内时间的延长而增强；脑脉通可使BMSCs移植的保护作用提前，并使中、后期的作用增强，其途径可能与减轻微血管基底膜LN和ColⅣ的降解有关。

关键词〔〕脑缺血；脑脉通；骨髓间充质干细胞；微血管完整性

1河南中医学院老年医学研究所

2宁夏医科大学中医学院3河南省人民医院

第一作者：刘轲(1966-)，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事中医药防治缺血性脑血管疾病研究。

脑微血管损伤是引起脑缺血再灌注损伤的重要病理机制，基底膜主要成分Ⅳ胶原对维持基底膜的完整性至关重要，层连蛋白对基底膜基质的组装起关键作用，保护脑缺血后的微血管完整性是治疗脑梗死的重要途径。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有多向分化潜能，可分化为神经、血管内皮、肌肉等多种细胞〔1，2〕。BMSCs移植后可与宿主大脑细胞整合并长期存活，并向神经元、星形胶质细胞及血管内皮细胞分化。因此，BMSCs移植被认为是治疗脑缺血理想的新途径〔3〕。前期研究表明，具有益气活血、降浊通脉作用的脑脉通颗粒(大黄，川芎，人参，葛根)对脑缺血神经元和微血管损伤具有显著的保护作用，脑脉通可使BMSCs移植保护脑缺血损伤的作用增强〔4，5〕。本实验拟就脑脉通对BMSCs移植保护脑缺血微血管受损的作用进行研究，为二者联合保护脑缺血损伤的应用提供依据。

1材料与方法

1.1实验材料SD大鼠，SPF级，3～4月龄，190只，雌雄各半，体重(300±50)g，由河南省实验动物中心提供(合格证号：410117号)；培养基D-MEM/F-12(GIBCO Invitrogen Corporation)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号051126)；0.25%胰酶(SIGMA-ALDRICH COMPANY， LTD.批号05401236)；倒置相差显微镜(Olympus optical Co.LTD， JAPAN，型号PM-10AD)；二氧化碳培养箱(SHELDON MANUFACTUREING， INC.MADE IN USA，型号T02323)；超净工作台(苏州净化仪器厂，型号：5W-CJ-1F)；混纤维滤膜(上海瑞丽分离仪器厂吴泾分厂)；细胞定量采集管(江苏通州市平潮镇求新玻璃仪器厂)；图像分析系统Image-Proplus5.1(Media Cybernetics Inc，USA，型号41N5100-44800)。

兔抗大鼠免疫球蛋白抗体(1∶100，IgG)；兔抗大鼠Ⅳ型胶原抗体(1∶100，type Ⅳ collagen，Ⅳ col)；兔抗大鼠层连蛋白抗体(1∶100，laminin，LN)；羊抗大鼠IgG-生物素；柠檬酸盐缓冲液；正常山羊血清封闭液；DAB显色试剂盒。

脑脉通颗粒(河南中医学院第一附属医院制剂室提供，批号050407，规格4 g/袋，每g脑脉通含生药3.75 g)。

1.2局灶性脑缺血动物模型参照改良的Longa法线栓阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型〔6〕。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰卧位固定大鼠，颈前正中切口，左侧钝性分离颈总动脉(CCA)；分离颈内外动脉，穿线备用，结扎翼颚动脉，于颈外动脉近动脉分叉处剪口，栓线穿入颈内动脉，缓慢推进，直至感觉有阻力为止，穿线成功后留出残断，以备拔线进行细胞移植，缝合皮肤，手术过程中保持大鼠肛温37℃，术后腹腔注射青霉素钠盐，每天40 000 U预防感染。

1.3BMSCs的培养、扩增与移植

1.3.1BMSCs悬液制备将2月龄(平均250 g)的雄性SD大鼠断颈处死，无菌条件下取出股骨、胫骨，除去骨表面附着的组织。用D-MEM/F-12培养液(含1万单位肝素)10 ml反复冲洗骨髓，充分吹打混匀后加入5 ml D-MEM/F-12培养基，重悬，收集骨髓细胞悬浮液。

1.3.2BMSCs的培养与扩增于骨髓细胞悬浮液中加入含10%FBS胎牛血清的D-MEM/F-12培养液，置于5%CO2培养箱内，3～4 d换液1次，弃去未贴壁的细胞后继续培养，倒置显微镜下观察细胞形态及生长，待细胞基本长满瓶底时(>80%)加入0.25%胰酶消化，胎牛血清终止消化，结束原代培养。

1.3.3BMSCs的重悬、计数与移植移植前对细胞进行离心，收集，生理盐水漂洗3次，进行细胞计数，重悬，每0.2 ml生理盐水中细胞数为2×106，单细胞悬液经颈内动脉移植入脑。

1.4分组与用药SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、脑脉通组、BMSCs移植组(简称移植组)、BMSCs移植联合脑脉通组(简称联合组)，假手术组10只大鼠，其余4组各45只大鼠又根据取材时间不同分为3组，即7、14、28 d组。

术前4 d脑脉通组和联合组分别给予脑脉通颗粒(每天40.5 mg/100 g，40.5 mg/ml)灌胃，假手术组、模型组和移植组以同等体积的生理盐水灌胃，每日1次；术后3 h缓慢拔出栓线进行再灌注；再灌注后24 h移植组和联合组颈内动脉给予BMSCs悬浮液200 μl，模型组、脑脉通组颈内动脉给予和BMSCs同等体积的生理盐水；移植后脑脉通组和联合组大鼠分别给予脑脉通灌胃，模型组和移植组大鼠给予同等体积的生理盐水灌胃，每周根据大鼠体重调整灌胃药物的用量和灌胃体积〔7〕，每天1次，直至取材。

1.5处理与取材假手术组大鼠于术后28 d取材，模型组、移植组、脑脉通组、联合组大鼠根据取材要求的时间点分别于颈总动脉用药后7、14、28 d麻醉大鼠，用4%的多聚甲醛溶液经升主动脉进行灌注固定，取出全脑，用4℃生理盐水冲洗3次，除去积血，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑半球，弃去右侧大脑半球，取左侧半球，从额极向后5 mm处冠状切取脑组织2 mm，置入4%多聚甲醛溶液(pH7.40)，待行HE染色和免疫组化测定。

1.6指标测定

1.6.1病理观察常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察脑缺血中心区微血管完整性的变化。

1.6.2内源性免疫球蛋白(IgG) 免疫组织化学观察石蜡切片经脱蜡、水化，3%的过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，10%的正常山羊血清封闭液封闭后，滴加兔抗大鼠IgG第一抗体，4℃过夜以进行抗原抗体特异结合。滴加生物素标记的第二抗体(羊抗大鼠IgG-生物素)，室温下孵育30 min。滴加链亲和素-过氧化物酶，室温下孵育30 min，滴加新鲜配制的DAB溶液，以上各步骤间均经PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3 min，自来水冲洗，苏木素复染，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。IgG表达在血管周围的脑组织内，光学显微镜下观察，阳性表达呈棕褐色，阴性呈蓝色；显微镜观察大鼠脑组织缺血侧IgG表达，随机选取缺血侧皮层3个视野；每组观察6张切片，合计18个视野；图像分析系统Image-Proplus5.1进行图像采集(显微镜20×10倍)；每幅图像采用盲法进行分析测量，设定图像分析系统的最大灰度分级为(Cmax)256，最大光密度值(Dmax)为2，阳性表达的灰度值与光密度呈反函数，灰度值的大小与阳性表达呈负相关，光密度值(即阳性表达的吸光值)大小与细胞阳性表达的强弱呈正相关；测定阳性表达的面积密度(Area)和平均光密度(Density)，计算整合光密度值(IOD)，计算公式IOD=Area×Density(mean)；以每视野阳性细胞的整合光密度值进行数据统计；阳性细胞个数越多、阳性反应的吸光值(IOD)越大，表示反应越强。

1.6.3脑组织Ⅳ型胶原和层连蛋白(LN)免疫组织化学染色制片过程同IgG，将第一抗体改为兔抗大鼠Ⅳ型胶原和LN抗体。Ⅳ型胶原和LN表达在血管的基底膜，光学显微镜下观察，阳性表达呈棕褐色，阴性呈蓝色；显微镜观察大鼠脑组织缺血侧Ⅳ型胶原和LN表达，视野的选取与整合光密度值(IOD)的计算同IgG。

1.7统计学处理方法采用SPSS11.0软件行单因素方差分析，不符合正态分布者进行数据转化后比较。

2结果

2.1一般情况实验大鼠动脉移植后大鼠死亡出现两个高峰，第一次于推液后3～5 d，大鼠毛色欠泽，精神差，多卧少动，不能主动觅食饮水，体重下降明显，易出现死亡；第二次于推液后9～11 d，大鼠增长缓慢，消瘦，分泌物污浊，易再次出现死亡；术后7 d大鼠体重下降明显，7～14 d体重渐有增加，14～28 d大鼠全身状况好转，体重增加明显。假手术组、模型组、脑脉通组、移植组、联合组各组7、14、28 d合计死亡动物只数为1、14、11、13、9；大鼠脑组织免疫组化染色过程中出现脱片、残片及背景泛染的标本剔除；纳入统计的标本数每组18只，平均每组每个时间点的动物为6只。

2.2大鼠脑组织微血管病理变化假手术组微血管基底膜光滑完整，分布薄厚均匀，血管内皮细胞清晰。模型组大鼠血管壁薄厚不均匀，微血管基底膜欠光滑，部分出现残缺、破损改变，血管内皮细胞排列不清晰，随再灌注时间延长血管结构破坏、微血管残缺不连续程度呈加重趋势。脑脉通组7 d的微血管结构改善明显，其作用随再灌注时间延长无明显变化；移植组7 d改善微血管受损的作用不明显，其14 d和28 d的作用显著；联合组大鼠各时间点微血管破坏减轻，其7、14和28 d微血管的变化程度一致。

2.3大鼠脑组织IgG表达变化假手术组神经元IgG呈弱阳性表达，模型组大鼠IgG表达强度均较假手术组明显增强，从7 d到14 d，随缺血再灌注时间延长呈增强趋势；与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点、移植组14 d和28 d的IgG表达均显著降低(P<0.01)；与移植组比较，联合组大鼠7 d和28 d的IgG阳性表达显著减弱(P<0.01)；联合组14 d和28 d的IgG阳性表达均较脑脉通组减弱(P<0.01，P<0.05)。不同时间点组比较，模型组和移植组14 d和28 d的IgG阳性表达均较7 d组减弱，联合组28 d的表达较其7 d和14 d减弱(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠脑组织IgG表达比较

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与移植组比较：3)P<0.01；与联合组比较：4)P<0.01;同一组内与7 d组比较：5)P<0.05，6)P<0.01；与同组内14 d组比较：7)P<0.05,下表同

2.4大鼠脑组织ColⅣ表达变化假手术组大鼠脑组织ColⅣ呈明显的阳性表达，模型组各时间点大鼠ColⅣ表达减弱(P<0.01)；与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点、移植组14 d和28 d大鼠脑组织ColⅣ表达均显著增强(P<0.01)；各联合组的ColⅣ表达均较移植组增强(P<0.01)；联合组14 d和28 d的表达较脑脉通组增强(P<0.01)。不同时间点组比较，模型组、脑脉通组14 d和28 d的ColⅣ表达均较其7 d减弱，移植组14 d和28 d的表达增强，联合组28 d的表达较其14 d增强明显(P<0.01)。见表2。

2.5大鼠脑组织LN表达变化假手术组大鼠脑组织LN呈明显阳性表达，各模型组大鼠LN表达减弱(P<0.01)；与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点、移植组14 d和28 d的LN表达均显著增强(P<0.01)；各联合组均较移植组的LN表达增强(P<0.01)；联合组14 d和28 d的表达较脑脉通组增强(P<0.01)。模型组、脑脉通组14 d和28 d的LN表达均较其7 d减弱，移植组14 d和28 d的表达较其7 d增强，联合组28 d的LN表达较其14 d显著增强(P<0.01)。见表3。

表2　各组大鼠脑组织ColⅣ表达比较

表3　各组大鼠脑组织LN表达比较值)

3讨论

脑缺血再灌注损伤可使毛细血管基底膜主要成分ColⅣ、LN、纤维黏连蛋白等降解，血脑屏障受损，毛细血管通透性增加，促使血管源性脑水肿发生，加重缺血性脑组织损伤〔8〕。脑缺血再灌注损伤与微血管基底膜ColⅣ和LN降解有关，随再灌注时间延长而加重〔9〕。脑缺血后脑微血管损害是以基底膜破坏为主，基底膜损伤一方面促进血栓形成，加重脑缺血；另一方面引起血管通透性增加，加重脑水肿。因此，保护脑缺血微血管基底膜的完整性具有重要意义。

当脑微血管完整性受损，引起血脑屏障通透性增加，IgG等大分子物质便可漏出至脑组织中，通过观察IgG在脑组织的表达水平反映血脑屏障的通透性〔10，11〕。本实验提示血脑屏障的损伤程度随脑缺血再灌注时间的延长呈持续加重趋势。

LN、ColⅣ是构成基底膜的主要物质，大鼠脑缺血再灌注损伤与血脑屏障基底膜成分ColⅣ、LN降解相关〔9〕。本文表明微血管基底膜的完整性受损程度在早期和中期随脑缺血再灌注时间的延长而加重，其变化趋势与前期的研究相似〔12〕，但出现高表达的时间较其延后，考虑与脑缺血再灌注时间的不同有关。

本实验发现，脑脉通持续减轻脑缺血再灌注损伤后血脑屏障通透性的作用明显，该作用可能与减少微血管基底膜LN、ColⅣ的降解有关。BMSCs能够合成细胞外基质，以修复受损的脑微血管〔13～15〕。可以认为，BMSCs通过保护脑微血管完整性发挥对神经损伤的修复作用。本文结果表明，BMSCs移植后血脑屏障的通透性降低明显，该作用可能与其减轻微血管基底膜LN、ColⅣ的降解相关，且随BMSCs移植脑内时间的延长，其降低血脑屏障通透性和减轻微血管基底膜损伤的作用呈增强趋势。脑脉通可使BMSCs移植后早期降低血脑屏障通透性的作用提前，并使其后期的作用增强。脑脉通对BMSCs移植后保护微血管完整性的作用可能是通过在脑缺血再灌注损伤早、中、晚三期减轻LN和ColⅣ降解而实现，其确切的作用机制有待进一步研究。

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〔2014-07-20修回〕

(编辑曲莉)

Effect of NaoMaiTong on the protection of the integrity of brain micrangium after BMSCs transplanting in rats with cerebral ischemia

LIU Ke， LI Jian-Sheng， LIU Jing-Xia，etal.

First Affiliated Hospital of Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450006， Henan， China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect on integrity of brain micrangium in rats with cerebral ischemia reperfusion injury after BMSCs transplantation， as well as the role of NaoMaiTong(NMT) in the protection of BMSCs transplantation. MethodsMiddle cerebral artery occlusion (MCAO) model was duplicated with nylon thread. Rats of transplantation and combination groups were transplanted with BMSCs via carotid artery at 24 h after operation. Brain micrangium pathological changes were observed by light microscope， and immunohistochemical method was used to determine the expressions of IgG， ColⅣ and LN. ResultsThe expressions of IgG were increased in rats brain of each model group(P<0.01). Comparing with that of model group， the expression of IgG was decreased in each NMT and combination groups， as well as in 14 d and 28 d transplantation groups(P<0.01). In comparison with those of 7 d and 28 d transplantation groups and 14 d and 28 d NMT groups， IgG expressions were decreased significantly in combination groups. The expressions of ColⅣ and LN were all decreased in each model group. Comparing with those of model groups， the expressions of ColⅣ and LN were increased in each NMT and combination groups， as well as in 14 d and 28 d transplantation groups(P<0.01). In comparison with those of 7 d and 28 d transplantation groups， 14 d and 28 d NMT groups，the ColⅣ and LN expressions were increased significantly in combination groups. ConclusionsNMT could make the effect of BMSCs transplantation ahead of schedule and enhance the protection in metaphase(14 d) and anaphase(28 d)， and the way might be related to soften the degradation of LN in earlier period and ColⅣ in metaphase and anaphase.

【Key words】Cerebral ischemia; Rhubarb Aglycone; BMSCs; Integrity of brain micrangium

通讯作者：李建生(1963-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事中医药防治老年病研究。

基金项目：国家自然科学基金(No.30973744)

中图分类号〔〕R743〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6014-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.005