生长激素释放肽6对心衰模型大鼠心肌细胞PI3K/Akt/Caspase-9信号通路蛋白表达的影响

陈立强　徐振宇　韩　曦　李梅秀　田国忠

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江　佳木斯　154007)



生长激素释放肽6对心衰模型大鼠心肌细胞PI3K/Akt/Caspase-9信号通路蛋白表达的影响

陈立强徐振宇韩曦李梅秀田国忠

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的研究生长激素释放肽(GHRP)-6对心力衰竭模型大鼠心肌细胞PI3K/Akt/Caspase-9信号转导通路蛋白表达的影响及保护作用机制。方法清洁级SD大鼠100只随机分为正常对照(A)组、假手术(B)组、模型(C)组和GHRP-6治疗(E)组。采用结扎大鼠左冠状动脉前降支制备心力衰竭模型，免疫组化法(SABC)检测各组左心室心肌细胞PI3K p110α、Akt p-Ser308和Caspase-9的表达情况。结果C组左心室心肌细胞中PI3K p110α和Akt p-Thr308 阳性表达量较A组、B组显著降低(P<0.05)，D组较C组显著升高(P<0.05)；C组Caspase-9阳性表达量较A组、B组显著增加(P<0.05)，D组较C组显著降低(P<0.05)。结论GHRP-6通过调控PI3K/Akt/Caspase-9信号转导途径来发挥其保护心肌的作用。

关键词〔〕生长激素释放肽(GHRP)-6；心力衰竭；PI3K；Akt；Caspase-9

第一作者：陈立强(1979-)，男，实验师，在读硕士，主要从事心力衰竭分子机制研究。

心肌死亡(坏死、凋亡、自噬等)的发生和神经内分泌系统过度激活所致的系统反应是心力衰竭发展过程主要因素，有效抑制这两个过程的发生和发展是预防和治疗心力衰竭的基础〔1，2〕。心力衰竭时，凋亡因子介导的各类凋亡途径均可以激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-9，启动Caspase级联反应，继而激活下游的Caspase-3和Caspase-7，导致细胞凋亡。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号转导通路是广泛存在于细胞中的信号转导通路，参与多种细胞功能的调节，Caspase-9是Akt下游的直接靶蛋白，PI3K/Akt可以通过直接或间接方式抑制其活性，从而抑制Caspase-9的促凋亡作用〔3〕。生长激素释放肽(GHRPs)是一类人工合成的具有刺激生长激素(GH)释放功能的氨基酸短肽，通过增加GH/胰岛素样生长因子(IGF)-1分泌来调控心脏收缩、心肌细胞凋亡、心肌细胞肥大等。本实验探讨GHRP-6对心力衰竭模型大鼠心肌细胞PI3K/Akt/Caspase-9信号转导通路蛋白表达的影响及其保护作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物和分组清洁级SD大鼠100只，2～3个月龄，体重(188.3±21.8)g，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，常规饲养。随机分为正常对照组(A组)、假手术组(B组)、模型组(C组)和GHRP-6治疗组(D组)，每组25只。

1.2主要药物和试剂GHRP-6，大连美仑生物技术有限公司；PI3K p110α和Caspase-9抗体，武汉博士德生物工程有限公司；Akt p-Thr308抗体，ExCell生物公司。

1.3造模与用药C组和D组：结扎大鼠左冠状动脉前降支制备心力衰竭模型，B组：左冠状动脉前降支穿线，不结扎。造模4 w后，D组按100 μg·kg-1·d-1剂量尾静脉注射GHRP-6溶液，其余组尾静脉注射等量生理盐水，连续注射4 w。

1.4取材与检测给药4 w末，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后摘除心脏，置于10%的中性甲醛溶液中，固定72 h。制作石蜡切片，应用免疫组织化学(SABC法)检测心肌PI3K p110α、Akt p-Thr308和 Caspase-9的表达情况，阳性表达为胞质内呈现棕黄色颗粒。使用IPP 6.0图像分析软件计算阳性染色的平均光密度值。

1.5统计学方法使用SPSS20.0软件进行单因素方差分析和双变量相关分析，两两比较采用LSD和SNK检验。

2结果

2.1免疫组化染色结果C组左心室心肌细胞中PI3K p110α阳性表达量较A、B组显著降低(P<0.05)，D组较C组阳性表达量显著升高(P<0.05)；C组Akt p-Thr308阳性表达量较A组、B组显著降低(P<0.05)，D组较C组阳性表达量显著升高(P<0.05)；C组Caspase-9阳性表达量较A组、B组显著增加(P<0.05)，D组较C组阳性表达量显著降低(P<0.05)。见表1、图1。

表1　各组心肌细胞内PI3K p110α、Akt p-Thr308和

与A、B组比较：1)P<0.05；与C组比较：2)P<0.05

2.2PI3K p110α与Akt p-Thr308及Akt p-Thr308与Caspase-9相关性心肌细胞内PI3K p110α与Akt p-Thr308阳性表达量呈高度正相关(r=0.829，P<0.05)；Akt p-Thr308与Caspase-9阳性表达量呈中度负相关(r=-0.556,P<0.05)。见图2。

图1　各组心肌细胞内PI3K p110α、Akt p-Thr308和 Caspase-9蛋白表达(SABC，×400)

3讨论

PI3K/Akt信号转导通路广泛存在细胞中，在心力衰竭的发病过程中其对于心肌细胞的生存、凋亡、心肌重构和炎症反应等一系列心肌保护作用的调节发挥着重要的作用。PI3K的激活依赖于受体酪氨酸激酶的活化和依赖于G蛋白耦联受体的活化〔4〕，一些生长因子(如IGF)的受体本身具有酪氨酸激酶活性(RTK)，被磷酸化激活的酪氨酸残基与PI3K p85亚基上的Sp结构域结合，p85与其结合后对异二聚体中PI3K p110的抑制作用解除，导致PI3K活化。GHRPs具有促进GH分泌的作用，能促使心肌表面IGF-1的分泌增加，IGF-1可以直接激活PI3K〔4〕。本实验结果表明PI3K在正常心肌细胞内有表达，心力衰竭时，各种刺激因素导致PI3K活性受到抑制，GHRP-6可以明显提高PI3K的活性。

激活的PI3K通过激活PIP3，使其与Akt的PH结构域结合暴露Thr308和Ser473位点，在PDK1/2的辅助下，使Thr308和Ser473位点磷酸化而激活Akt〔5〕，本实验结果表明Akt的活性程度与PI3K的活性程度相一致，Akt的活性直接受PI3K的调控，GHRP-6可以通过激活PI3K来调控Akt的活性。

心肌细胞凋亡是心力衰竭时重要的发病机制，各种凋亡因素可以引起线粒体膜通透性改变而造成细胞色素C的释放，细胞色素与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1结合，形成多聚复合体，通过募集胞质中的procaspase-9，使其自我剪切活化成有活性的Caspase-9，继而启动Caspase级联反应，导致细胞凋亡；Caspase-9是Akt的直接靶蛋白，活化的PI3k/Akt信号通路可以使Caspase-9的Ser196位点磷酸化，导致Caspase-9失活，使其不能剪切、活化下游的procaspase-3，而抑制其引发级联反应的促凋亡作用〔6〕。实验报道〔7〕证实，在心衰动物模型和细胞模型中通过调控PI3K/Akt信号转导通路，可以抑制Caspase-9和Caspase-3表达，降低了心肌细胞的凋亡。本实验结果表明GHRP-6作用于心力衰竭模型大鼠后，可以通过激活PI3K启动下游靶蛋白Akt，激活的Akt抑制Caspase-9的活性，进而抑制细胞凋亡，推测GHRP-6可能通过调控PI3K/Akt/Caspase-9信号转导途径来发挥其保护心肌的作用。但鉴于心力衰竭时PI3K/Akt调控机制的复杂性，要探究GHRPs对于其更详细的作用机制，需要深入研究。

参考文献4

1中华医学会心血管分会，中华心血管病杂志编辑委员会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2014〔J〕.中华心血管病杂志，2014；42(2)：98-122.

2Shah AM，Mann DL.In search of new therapeutic targets and strategies for heart failure：recent advances in basic science〔J〕.Lancet，2011；378(9792)：704-12.

3李敏，林俊.细胞凋亡途径及其机制〔J〕.国际妇产科学杂志，2014；41(2)：103-7.

4Denley A，Gymnopoulos M，Kang S，etal.Requirement of phosphatidylinositol(3，4，5) trisphosphate in phosphatidylinositol 3-kinase-induced oncogenic transformation〔J〕.Mol Cancer Res，2009；7(7)：1132-8.

5Chen J，Alberts I，Li X.Dysregulation of the IGF-I/PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in autism spectrum disorders〔J〕.Int J Dev Neurosci，2014；35(1)：35-41.

6刘玉梅，祖桂芳，赵晓红，等.Akt/PKB抗凋亡机制与天然活性物质的抗肿瘤作用〔J〕.生命科学，2011；23(1)：1-6.

7Hussain A，Gharanei AM，Nagra AS，etal.Caspase inhibition via A3 adenosine receptors：a new cardioprotective mechanism against myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Drugs Ther，2014；28(1)：19-32.

〔2014-07-19修回〕

(编辑苑云杰)

The effects of GHRP-6 on PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway in myocardial cells of heart failure rats

CHEN Li-Qiang, XU Zhen-Yu, HAN Xi,etal.

College of Basic Medical Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo study the protective mechanism of growth hormone-releasing peptide (GHRP)-6 on myocardial cells of rats with congestive heart failure by observating the effects of GHRP-6 on heart functions and PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway. Methods100 healthy SD rats were divided into 4 groups randomly: control group (A), sham group (B), heart failure group (C) and GHRP-6 treated group (D). The left anterior descending coronary artery was ligated to produce heart failure model. The expression of PI3K p110α, Akt p-Ser308 and Caspase-9 were detected by immunohistochemical method(SABC). ResultsThe expression of PI3K p110α and Akt p-Thr308 in left ventricular posterior wall and interventricular septum of C group was decreased than that of A and B groups (P<0.05), the expression level in D group was higher than that of C groups(P<0.05). The caspase-9 level of C group was higher than that of A and B groups (P<0.05) and the expression level in D group lower than that of C group(P<0.05). ConclusionsGHRP-6 can protect the myocardium via regulating PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway.

【Key words】GHRP-6; Heart failure; PI3K; Akt; Caspase-9

通讯作者：田国忠(1966-)，男，教授，医学博士，博士生导师，主要从事心脏神经-内分泌-免疫调控研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81370342)；佳木斯大学研究生创新项目(No.LZZ2014003)

中图分类号〔〕R541.6〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6005-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.002