豨莶草提取液对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用

张　磊　王彦永　刘　佳　于　静　杨树民

(河北医科大学第一医院药剂科，河北　石家庄　050031)



豨莶草提取液对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用

张磊王彦永1刘佳2于静杨树民

(河北医科大学第一医院药剂科，河北石家庄050031)

摘要〔〕目的探讨豨莶草提取液对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)损伤的保护作用及机制。方法在生长状态良好的PC12细胞中加入终浓度为400 μmol/L的MPP+，造成帕金森病(PD)的离体实验模型，并观察豨莶草提取液对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用。倒置显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞活力，通过DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果400 μmol/L MPP+作用PC12细胞能明显抑制细胞生长，造成细胞发生损伤，ROS水平增加。同时给予不同浓度豨莶草提取液，PC12细胞存活率明显增加，ROS水平显著降低。结论豨莶草提取液能有效改善MPP+诱导的PC12细胞的损伤，其作用机制可能与降低ROS水平有关。

关键词〔〕帕金森病；豨莶草；1-甲基-4-苯基吡啶离子；PC12细胞；活性氧

1河北医科大学第一医院神内科2河北医科大学第一医院营养科

第一作者：张磊(1979-)，男，主管药师，主要从事临床药理学研究。

帕金森病(PD)是发生在中老年期的一种常见慢性神经退行性疾病〔1〕，临床表现为静止性震颤、肌强直和运动迟缓等症状，病理变化主要为黑质致密区(SN)多巴胺(DA)能神经元进行性死亡或缺失〔2〕。目前该病的发病机制尚不明确，但有研究表明，在PD中选择性DA能神经元损伤与细胞凋亡密切相关〔3〕。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)是一种DA能神经元毒性剂，被广泛应用于PD发病机制和药效学评价的研究〔4〕。豨莶草为常用中草药，是一年生草本植物豨莶 、腺梗豨莶或毛梗豨莶的全草〔5〕。据报道，豨莶草有抗炎〔6，7〕、抗风湿〔8〕、降压〔9，10〕、抗肿瘤〔11〕等多方面的作用。娄月芬等〔12〕研究证明，豨莶草提取液能明显保护脑缺血再灌注的大脑皮层神经元损伤模型，其机制与豨莶草抗氧化作用有关。但是关于豨莶草提取液治疗PD的物质基础和具体作用机制在国内外还未见报道。本实验探讨豨莶草提取液治疗PD的作用和机制。

1材料和方法

1.1主要试剂豨莶草购自河北祁新中药颗粒有限公司，经河北省药品检验院段吉平主任药师鉴定为腺梗豨莶的地上部分，水煎煮提取，低温浓缩，提取物浓度为2 mg/ml(以总黄酮计)；96孔培养板购自美国Corning公司；MTT、DMSO和MPP+均购自Sigma公司；DCFH-DA购自Sigma公司；DMEM培养基，胎牛血清和马血清购自Gibco BRL公司。

1.2主要仪器倒置荧光显微镜(日本Olympus公司产品；IX70)；CO2培养箱(德国，HERAD-63450)；酶标仪(美国 Bio Rad3550)。

1.3细胞培养和药物处理PC12细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，由本实验室传代并保存。PC12细胞置于含5%胎牛血清，10%马血清的DMEM培养液中，并在含5% CO2的37℃培养箱中培养，细胞每2～3天更换1次培养液，当细胞长到80%即可传代培养。将生长状态良好的细胞以2×105/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，24 h细胞贴壁后弃去培养液，每孔加入含不同浓度(100、250、400、550 和700 μmol/L)MPP+和(或)豨莶草提取物的培养液100 μl，继续培养。

1.4实验分组实验分空白对照组：无细胞，并加入不含MPP+的培养液；阴性对照组：细胞正常培养，不给予任何处理试剂；MPP+处理组：MPP+单独处理PC12细胞；豨莶草提取物+MPP+组：豨莶草提取物设三个浓度(2.00、4.00和8.00 μg/ml)，MPP 浓度为400 μmol/L。每组各设定6个复孔。

1.5细胞形态学观察将各组细胞放置于倒置显微镜下观察细胞形态学改变情况并拍照记录。

1.6MTT比色法检测细胞增殖活性在培养板上接种处于指数生长期的PC12细胞，每孔加细胞悬液100 μl，接种量2×105/ml，加入等体积、不同浓度的豨莶草提取物或MPP+。MPP+处理组加入含MPP+的等体积溶剂，豨莶草提取物+MPP+组加入等体积的混合溶液，并分别设6个复孔，继续培养48 h。在结束培养前4 h，每孔加入MTT 溶液20 μl，继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡5 min后，酶标仪490 nm处检测每孔的吸光度(A)值。细胞存活率=(阴性对照组A值-空白对照组A值)/(加药组A值-空白对照组A值)×100%。

1.7PC12细胞内ROS水平的检测按照试剂盒使用说明书进行操作。PC12细胞内ROS水平采用荧光探针DCFH-DA孵育后，荧光显微镜下进行观察。将PC12细胞接种于24孔培养板，分组干预，每组设定6个复孔。干预结束后，每孔加入DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L，37℃避光孵育60 min，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察细胞内DCF荧光强度，检测结果采用HMIAS-2000型图文分析软件进行分析。

1.8统计学方法应用SPSS13.0 软件进行t检验、单因素方差分析及q检验。

2结果

2.1MPP+对PC12细胞的影响MTT检测结果显示，正常 PC12细胞给予不同浓度MPP+(100，250，400，550和700 μmol/L)48 h后，细胞存活率随药物浓度的增加而呈剂量依赖性降低〔(88±7.03)%、(77±5.46)%、(56±6.23)%、(32±6.88)%、(26±3.12)%〕。当MPP+浓度在400 μmol/L时，细胞存活率基本维持在60%左右。为使细胞处于损伤状态又不致使细胞过度死亡，本实验选择400 μmol/L的MPP+构建PC12细胞损伤模型。

2.2豨莶草提取液对MPP+损伤的PC12细胞形态学改变的影响正常PC12细胞呈圆形、梭形或多边形，为贴壁生长细胞，可有一到多条的类似神经突起的细胞突起出现，细胞生长迅速，培养12～24 h后细胞成簇生长，2～3 d后突起明显增多增长，可见多数突起从细胞边缘发出，相互连接成网状，在倒置显微镜下呈强折光性，核不易见。加入MPP+损伤后，细胞先肿胀，折光度增强后，细胞圆缩、脱落。400 μmol/L的MPP+作用于PC12细胞后4～5 h即可见部分细胞体肿胀，细胞形态改变，折光减弱，作用24 h后，大部分PC12细胞胞体变小、变圆，失去折光性，细胞突起明显减少、缩短，细胞之间的突起连接明显减少。细胞可由贴壁生长脱落到细胞培养液中悬浮，随着培养时间的延长活细胞逐渐减少。经过豨莶草提取液处理的PC12细胞，细胞形态学的改变与模型组PC12细胞比较有明显的改善。在显微镜下见活细胞数明显增加，细胞的脱落率下降，细胞的贴壁率提高，细胞折光性增加，细胞间仍可见比较多的细胞联系，细胞仍以簇状生长为主，散在单一的细胞较少，接近正常组细胞。豨莶草提取液能明显改善PC12细胞的损伤状态(图1)。

2.3豨莶草提取液对MPP+损伤的PC12细胞存活率的影响MTT结果显示，400 μmol/L MPP+导致PC12细胞存活率较对照组明显下降〔(54±4.24)%vs(100±7.11)%〕，同时给予不同浓度豨莶草提取液可增加细胞存活率，在2.00、4.00、8.00 μg/ml范围内具有浓度依赖性，其中4.00〔(72±6.14)%〕和8.00 μg/ml〔(81±6.71)%〕浓度组与MPP+处理组比较差异显著，表明豨莶草提取液对MPP+诱导PC12细胞凋亡具有一定的抑制作用。

2.4MPP+与豨莶草提取液对PC12细胞ROS的影响MPP+与PC12细胞孵育48 h后，细胞内ROS水平明显高于对照组(507±27 vs 230±20，P<0.01)。加入8.00 μg/ml的豨莶草提取液干预后细胞内ROS水平明显低于MPP+组〔(348±25)，P<0.05〕。见图2。

A：对照组 B：MPP+处理组；C：4.00 μg/ml豨莶草提取物+MPP+ 处理组，下图同图1　豨莶草提取液对MPP+损伤的PC12细胞形态学观察(×100)

图2　DCFH-DA 检测细胞内ROS(×100)

3讨论

PD残留的神经元内出现以异常修饰和聚集的突触核蛋白为主要成分的嗜酸性包涵体——路易体(LB)〔13〕。目前PD的发病机制仍不明确，许多学者认为氧化应激损害，尤其是DA通过非酶促的自氧化产生活性氧簇(ROS)可能是导致DA能神经元选择性损伤的重要原因〔14〕。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，它能表达酪氨酸羟化酶并且合成多巴胺，因而也被称为多巴胺能细胞。MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)在体内的代谢产物，MPP+作用于PC12细胞建立的细胞模型已得到国内外学术界公认，并被广泛用于PD的实验研究〔15〕。本研究发现，与阴性对照组比较，MPP+处理组细胞活性降低，ROS水平升高；而豨莶草提取液对细胞活性的降低和细胞内ROS水平的升高具有抑制作用。因此，我们推测豨莶草提取液可能通过抑制细胞内ROS的水平，减少神经元的损伤，从而发挥抗PD的作用。但豨莶草对神经元凋亡的具体作用及保护机制、信号转导等还有待于进一步研究。

参考文献4

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〔2015-06-17修回〕

(编辑曹梦园)

通讯作者：王彦永(1976-)，男，副主任医师，硕士生导师，主要从事脑小血管病研究。

中图分类号〔〕R742.5〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7042-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.033