手性配体交换色谱的研究进展

王小平，沈芒芒，童胜强

(浙江工业大学　药学院，浙江　杭州　310032)



手性配体交换色谱的研究进展

王小平，沈芒芒，童胜强*

(浙江工业大学药学院，浙江杭州310032)

手性药物不同对映体的药效活性与药理毒性往往具有一定的差异，因此单一光学活性手性药物的研究对人类健康具有十分重要的意义，并且已广泛引起了人们的重视[1]。目前手性药物分离与分析的方法较多，而手性配体交换色谱法是手性药物研究最有效的方法之一，特别是氨基酸与羟基酸的手性分离。手性配体交换色谱法，是将配体交换原理与具有高速、高效、高灵敏度色谱技术相结合的方法。现阶段较为常见的主要有手性配体交换液相色谱、手性配体交换电泳等。目前，关于手性配体交换色谱的综述性文章主要介绍了手性配体交换色谱的基本原理[2-3]，手性配体交换液相色谱[4]，手性配体交换毛细管电泳[5-7]等，该类文章展现了数十年来手性配体交换色谱的发展历程。本文主要以各种手性试剂、配位体系进行分类，综述了近年来手性配体交换液相色谱、手性配体交换电泳以及手性配体交换逆流色谱等领域的最新研究进展，包括手性配体交换色谱的原理、影响因素以及相关数据模拟机制，并对手性配体交换色谱的研究前景进行了展望。

手性配体交换通常基于手性配体、金属离子与待测手性物质之间形成非对映体的三元配合物，根据不同对映体形成的三元配合物之间空间位阻、热力学稳定性与动力学可逆性等差异导致的保留时间与保留体积的差异，达到分离的目的[8-9]。主要机理如下：

[CL]n M+ l-R→[CL]n-1Ml-R+CL(n>1)

(1)

[CL]n M+ d-R→[CL]n-1Md-R+CL(n>1)

(2)

其中，[CL]n表示配体，M为金属原子，R为外消旋化合物，形成的三元配合物[CL]n-1Ml-R和[CL]n-1Md-R均为非对映体体系。

1手性配体交换液相色谱法

高效液相色谱(HPLC)是20世纪70年代快速发展起来的一种分离分析技术，具有高效、高灵敏度等优点，是现阶段物质检测与分析不可缺少的检测方法之一。Davankov首次将配体交换的原理应用于液相色谱技术中，并对α-氨基酸进行了手性分析[10]，随后部分学者展开了相关研究[11-13]。目前手性配体交换液相色谱法主要有固定相涂渍法以及流动相添加法。

1.1固定相涂渍法

固定相涂渍法是将配体交换的原理运用于固定相中，对固定相进行一定的改性，利用不同手性类型的物质与固定相形成的三元配合物的稳定性差异，达到分离的目的，在物质的手性分离上具有很好的应用。对固定相的改性主要通过在固定相机体上引入手性化合物以及金属离子等实现。

1.1.1手性配体涂渍法固定相涂渍最常用的手性配体主要有氨基酸、青霉胺等。经改性后的固定相，与流动相中的金属离子以及分析物之间形成三元配位体系，而形成的不同配合物因其稳定性差异可达到分离。Song等[14]采用L-脯氨酸和L-羟脯氨酸对经链端延长的巯丙基硅胶进行改性，合成了两种手性配体色谱柱，对6种氨基酸对映体进行了分离；Su等[15]通过在Phenomenex chirex 3126手性色谱柱上键合D-青霉胺，使其与流动相中的Cu2+、肌肽对映体形成三元配合物，利用两种配合物之间稳定性的差异，实现了肌肽对映体的有效分离。

除了采用常规的氨基酸及其衍生物键合外，采用N-((R)-2-羟基-1-苯乙基)-N-十一碳氨基乙酸盐及其类似物等键合的新型手性固定相也逐渐被用于多种手性物质的分离。Gecse等[16]采用键合N-((R)-2-羟基-1-苯乙基)-N-十一碳氨基乙酸钠的手性色谱柱，成功地对β-氨基酸进行了手性分离。而该键合手性固定相，除了可对氨基酸进行手性分离外，还可对质子泵抑制剂进行手性分离，如奥美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑以及雷贝拉唑等[17-18]。另外，键合了N-((S)-1-羟甲基-3-甲基丁基)-N-十一碳氨基乙酸钠的手性固定相也可对质子泵抑制剂进行手性分离[19]。

1.1.2金属离子涂渍法液相色谱中最常用的固定相是硅烷键合硅胶，以往最为常用的改性固定相的金属离子为Cu2+，近年来，Ti4+也常作为固定相的改性金属离子进行应用。Tan等[20]采用二氧化钛填料色谱柱，对硫胺素进行了手性分离；Zhao等[21]采用经钛离子改性的色谱柱对大豆卵磷脂中的磷脂酰胺进行了测定。Wei等[22]采用二氧化钛改性的固定相，利用配体交换与亲水作用的原理对食物中的苯甲酸与香草醛进行了检测。

1.1.3混合涂渍法混合涂渍法主要是指采用手性物质与金属离子形成的化合物对色谱柱固定相进行共同改性，该法对物质的手性分离同样具有很好的效果。Mayani等[23]采用经氨基乙醇改性的固定性与醋酸铜反应，形成新型的氨基乙醇-铜固定相，采用配体交换原理对扁桃酸等进行了手性分离。

1.2流动相添加法

(3)

图1　手性配体交换流动相添加法HPLC的保留模型Fig.1　Retention model for HPLC with chiral ligand exchange mobile phaseAm,As：analytes in mobile and stationary phase(流动相与固定相中的被分析物);CuLm,CuLs：copper(Ⅱ)-L-amino acid complex in mobile and stationary phase(流动相和固定相中的Cu(Ⅱ)-L-氨基酸混合物)；KA,KCuL，KACuL：partition coefficient for A,CuL and ACuL(物质A、CuL和 ACuL的吸附平衡常数)；：chemical equilibrium constant in mobile and stationary phase(流动相和固定相中配体交换过程的化学平衡常数)

采用添加手性配体流动相的方法，可对多种手性物质进行分离。Keunchkarian等[25]采用金鸡纳碱与等摩尔的Cu2+为手性配体剂，对几种α-氨基酸及其衍生物的外消旋体进行手性分离。氨基酸离子是目前使用最为普遍的手性添加剂。采用L-苯丙氨酸作为手性添加剂可对雌三醇与3,4-二甲氧基-α-甲基苯甲酸进行手性分离[26]。Bi等[27]采用L-亮氨酸与Cu2+作为添加剂加入到流动相中，对氧氟沙星制剂药物中的氧氟沙星对映体进行了手性分离，同时对离子溶液的手性与非手性进行了探讨，指出手性离子溶液的分离效果更加明显。Zhou等[28]采用异亮氨酸作为手性添加剂，对扁桃体酸进行了手性分离。笔者所在课题组则对常规的氨基酸进行了结构改造，将合成的N-二甲基苯丙氨酸作为手性添加剂，对扁桃酸进行了手性分离[24]。

Jeong等[29]采用配体交换液相色谱技术对糖尿病进行了诊断，通过测定试验者干血清中L-别异亮氨酸与L-苯丙氨酸的比例对其进行判断。

1.3手性配体交换液相色谱法的影响因素

手性配体交换液相色谱技术对手性物质的分离与诸多因素有关，如温度、金属离子类型及浓度、色谱柱类型、流动相pH值等。不同金属离子与手性物质形成的配合物不同，配合物的稳定性存在一定差异，因此，实验中对金属离子种类与浓度的考察至关重要。目前，最为常用的金属离子是络合稳定性较好的Cu2+。此外，有研究者提出，金属离子的成盐形式对物质的手性分离同样具有影响。Natalini等[30]使用不同的铜盐形成的配体交换体系，对多种氨基酸的分离因子进行了比较。结果发现，使用不同的铜盐，氨基酸的分离因子大致趋势为：硝酸盐>甲酸盐>溴化盐>硫酸盐>三氟化盐>氯化盐>高氯酸盐>醋酸盐。发生上述情况的具体原因尚不明确，但有研究者认为可能与体系的表面静电平衡(ESPbal)有关[31]。另外，对于不同分析物质，选择合适的色谱柱至关重要。Alizadeh等[32]使用配体交换液相色谱法对阿替洛尔进行手性分离时，发现使用C8柱比C18柱具有更好的分离效果。流动相pH值对手性分离的影响较大，通常碱性条件下络合物的形成较为容易，但pH值过大时则会对色谱峰的峰形产生影响。

2手性配体交换电泳法

2.1手性配体交换电泳法的应用

手性配体交换电泳法结合了配体交换技术与电泳技术的优点，具有分离模式多、样品消耗少、操作简便等优点，是近年来手性分离中较为常用的方法。目前，最常用的手性配体为氨基酸类，一些新型的手性配体试剂也逐渐被合成[33]。而金属离子主要有Cu2+，Zn2+，Al3+，Co2+，Cd2+等。按照金属离子的不同，表1分别列出了手性配体交换电泳近几年的配体交换体系以及被分离物质。

2.2手性配体交换电泳法的影响因素

电压是电泳的重要参数，分析时间随着电压的增高而缩短，而分离度则先增加后减小。缓冲溶液的pH值对溶液的离子化程度具有直观影响，因而对分离度的影响也尤其重要。pH值的增高有利于金属离子与配体形成的物质更加稳定，但pH值过高则会造成配合物过于稳定，使得其与被分析物之间难以交换，从而导致分离度下降。金属离子的种类与浓度也是影响手性配体交换电泳法的重要因素，不同的手性物质配位的金属离子不同。Liu等[34]分别采用Cu2+，Zn2+，Mg2+和Ni2+与四甲基铵L-羟脯氨酸作为手性添加剂，对色氨酸与3,4-二羟基苯丙氨酸进行了手性拆分，结果发现只有Cu2+起到了很好的分离作用。同时，其还对Cu2+浓度进行了考察，发现Cu2+浓度过高或过低均会降低分离度，实验过程中应筛选合适的Cu2+浓度，以达到较好的分离效果。Aizawa等[45]研究发现，金属离子与手性配体以及待测物之间不同的浓度比对物质的手性分离亦具有一定影响。离子溶液的种类与烷基链的长度对手性分离同样具有一定的影响。Zhang等[46]采用Zn2+与L-精氨酸作为配位体系，使用几种不同结构的离子溶液对丹酰氨基酸的手性分离进行考察，发现适宜结构的离子溶液对手性分离的影响很大，为科研工作者的进一步研究提供了有效的参考。

表1　手性配体交换电泳法中的各种配位体系与分离物质

3手性配体交换逆流色谱

逆流色谱属于液液分配色谱，与液相色谱相比其突出优势在于固定相不使用固体载体，样品回收率为100%。现代逆流色谱仪器简单易维护、运行成本低，且属于制备色谱技术范畴，在手性分离领域具有较好的应用前景。目前，关于手性配体交换逆流色谱的相关报道较少。Takeuchi等[47]首先将手性配体交换原理与液液色谱原理相结合，采用逆流色谱技术，以Cu2+作为金属离子，N-n-十二烷基-L-脯氨酸为手性配体试剂，对异亮氨酸进行了手性分离。随后，Takeuchi等[48]又采用该技术对缬氨酸进行了手性分离。笔者所在课题组研究了手性配体交换逆流色谱技术的原理与应用[49]，制备拆分了5种扁桃酸系列外消旋体。研究中发现采用同样的手性配体与金属离子作为中心离子，液相色谱无法拆分的某些外消旋体，采用手性配体交换高速逆流色谱技术可以获得良好的拆分。

4结论与展望

将手性配体交换技术与色谱技术联用，结合了配体化学与色谱分离两个领域的特征，该方法无需衍生化，分析检测方便快捷，显著提高了对映体物质的分离效率，对手性药物的研究具有十分重要的意义。本文介绍的3种手性配体交换色谱中，目前研究较为普遍的是手性配体交换液相色谱与手性配体交换电泳，而关于手性配体交换逆流色谱的报道较少，仍具有广泛的研究空间。

现阶段关于手性配体交换色谱的研究主要有两个方向：首先，手性配体试剂是手性配体交换色谱法的关键因素，更加高效且通用的手性配体试剂是手性配体交换色谱最重要的研究方向。目前最为常用的手性配体试剂主要为一些氨基酸、羟基酸及其衍生物等，且分离的手性物质也较为狭隘。而其他手性试剂的不断尝试，必将拓宽手性配体交换色谱的分离空间。其次，手性配体、金属离子与对映体之间形成三元络合物的稳定性受多种因素的综合影响，如空间位阻、热力学稳定性以及动力学可逆性等，寻求众多因素之间的平衡点会使手性分离更加高效快速，现阶段各种模拟保留机制软件的利用则会使未来的手性配体机制更加清晰。

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摘要：手性配体交换色谱技术将配体交换原理与色谱技术相结合，拓宽了液相色谱、电泳以及逆流色谱的应用层面，为部分难分离手性物质提供了有效的分离与检测方法。该文参考了近年来国内外的相关文献，综述了手性配体交换技术在液相色谱、电泳与逆流色谱等领域中的应用进展；总结了手性配体交换色谱技术的基本原理、影响因素、优缺点等，并对手性配体交换色谱技术的趋势进行了展望。

关键词：配体交换；液相色谱；电泳；逆流色谱；研究进展;综述

Study Progress of Chiral Ligand Exchange ChromatographyWANG Xiao-ping,SHEN Mang-mang,TONG Sheng-qiang*

(College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310032,China)

Abstract：Chiral ligand exchange chromatography is a kind of technique which combines ligand exchange principle with chromatography.The development of chiral ligand exchange strategy has extended the applications of high performance liquid chromatography,electrophoresis and high speed counter current chromatography.This method provides an effective way for the enantioseparation of racemates which are difficult to be enantioseparated by other methods.Applications of chiral ligand exchange in liquid chromatography,electrophoresis and high speed counter current chromatography are summarized.The basic principle，effecting factors,advantages and disadvantages of chiral ligand exchange chromatography are systematically reviewed.Finally,the development trends of chiral ligand exchange chromatography are proposed.

Key words：chiral ligand exchange;liquid chromatography;electrophoresis;high speed counter current chromatography;research progress;review

中图分类号：O657.7;G353.11

文献标识码：A

文章编号：1004-4957(2015)12-1446-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.021

通讯作者：*童胜强，博士，副教授，研究方向：色谱技术在手性拆分上的应用，Tel：0571-88320613，E-mail：sqtong@zjut.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(21105090)；浙江省高等学校中青年学科带头人攀登项目(pd2013031)

收稿日期：2015-04-14；修回日期：2015-05-18