同位素稀释/液相色谱-串联质谱测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素

赵孔祥，娄婷婷，何　佳，陈其勇，葛宝坤，郑文杰

(天津出入境检验检疫局，天津　300461)



同位素稀释/液相色谱-串联质谱测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素

赵孔祥*，娄婷婷，何佳，陈其勇，葛宝坤，郑文杰

(天津出入境检验检疫局，天津300461)

婴幼儿配方奶粉在婴幼儿营养中占有很重要的地位，由于婴幼儿食物来源单一，婴幼儿配方奶粉必须含有满足婴幼儿生长发育需要的各种营养素，且搭配合理，其中很重要的一类是脂溶性维生素。脂溶性维生素主要有维生素A(视黄醇)、维生素D(D2和D3)、维生素E(主要为α-生育酚)和维生素K(维生素K1)。脂溶性维生素能够调节人体的各种生理机能，增强免疫力，促进骨骼的生长发育，调节体内各方面的代谢等。

测定脂溶性维生素的液相色谱方法已有很多[1-5]，但由于配方奶粉的蛋白质及脂肪含量高，前处理复杂，维生素含量差别大且测定灵敏度较低等原因，多种脂溶性维生素同时测定的方法较少[4-6]。液相色谱-质谱法具有高灵敏度、高通量及高选择性等特点，在脂溶性维生素检测中的应用越来越多[9-14]。同位素稀释技术中每种目标物均使用自身的同位素内标进行定量，可校正前处理过程的损失，降低基质效应，提高定量的准确性[12-15]。本文采用同位素稀释/液相色谱-串联质谱技术实现了多种脂溶性维生素的同时检测，简化了实验操作步骤，节省了人力、物力。

1实验部分

1.1仪器与试剂

TSQ Quantumn Ultra液相色谱-串联质谱仪，Xcalibur操作软件(美国Thermo公司)。恒温振荡器(常州普天仪器公司),GR22GⅢ高速离心机(日本日立公司)，R210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)，Milli-Q 纯水器(美国Millipore公司)，涡旋混匀器(美国Votex公司)。

脂肪酶，活力≥20 000/g(美国Sigma-Aldrich公司)；淀粉酶，活力≥1.5 U/mg(美国Sigma-Aldrich公司)，甲醇、甲酸、石油醚(色谱纯，美国迪马公司)；抗坏血酸(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；无醛乙醇(优级纯，天津市化学试剂研究所有限公司)；维生素E(α-生育酚)、维生素D2、维生素D3、维生素K1(含量均>99%，美国Supelco公司)。维生素A(视黄醇，含量>99%)、维生素D2-3d(美国Sigma-Aldrich公司)。维生素A-3C13(新西兰Buchem公司)，维生素D3-3d(美国Isosciences公司)，维生素E-6d和维生素K1-7d(加拿大Toronto Research Chemical公司)。配方奶粉标准参考物质(SRM 1849a,美国Nist公司)。

1.2色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A相为0.02%甲酸-甲醇溶液，B相为0.1%甲酸-水溶液。梯度洗脱程序：0～1.0 min，90%～95%A；1.0～6.0 min，95% A；6.0～7.0 min，95%～100%A；7.0～11.0 min，100%A；11.0～12.0 min，100%～90%A；12.0～15.0 min，90%A。流速0.4 mL/min；柱温：室温；进样量10 μL；同位素稀释内标法定量。

1.3质谱条件

离子源电离模式：正离子大气压化学电离(APCI+)，电晕电流 6 μA，雾化条件：蒸发器温度400 ℃，鞘气压力 275.7 kPa，辅助气压力 68.9 kPa。数据采集选择多反应监测模式(MRM)，详细参数见表1。

表1　脂溶性维生素的MRM参数

* quantitative ion

1.4样品制备方法

精密称取1.0 g样品，加入100 μL同位素内标溶液(D2-3d、D3-3d为1 μg/mL，A-3C13为10 μg/mL，E-6d为50 μg/mL，K1-7d为5 μg/mL)，并加入0.2 g抗坏血酸，用10 mL 50～60 ℃温水溶解，混匀后，加入脂肪酶0.5 g(含淀粉样品应同时加入0.5 g淀粉酶)，(37±2) ℃振摇过夜。取出酶解样品，加入15 mL乙醇与1.0 mL 10 mol/L的氢氧化钾溶液，振摇混匀，(50±2) ℃下水解1 h。取出，迅速冷却至室温，加20 mL石油醚溶液振摇2 min，5 000 r/min离心5 min，转移上层有机相，下层液体再加入20 mL石油醚溶液振摇2 min，5 000 r/min离心5 min，合并上层有机相。旋转蒸发浓缩至干，用石油醚转入试管中，氮气吹干，加入 2 mL乙醇充分溶解，经微孔滤膜过滤，待上机测定。

2结果与讨论

2.1质谱条件的优化

采用大气压化学电离[9,13]和电喷雾电离[10-12]对脂溶性维生素进行检测的研究已有报道。通过直接进样，分别试验大气压化学电离与电喷雾电离方式下各脂溶性维生素的电离情况，结果显示，采用APCI+模式时，准分子离子峰信号最强，这是由于脂溶性维生素的极性小，APCI模式更易使其电离。各维生素均可获得丰度较高的[M+H]+母离子，优化APCI其他电离参数，根据欧盟(2002/657/EC)指令，每个母离子选择两个子离子，优化碰撞能量和选择子离子，确定多反应监测模式下信号采集的特征离子对(见表1)。

由于样品中维生素E的含量较高，通常为mg/100 g水平，当选择响应最强的离子对m/z431>167时，标准曲线范围(1～100 μg/mL)内，其最高浓度的峰高超过108，响应超过了仪器的最佳线性范围，线性回归实验也证明此点严重偏离，因此选择次强离子对m/z431>137作为定量离子对,维生素E在1～100 μg/mL标准溶液范围内的线性相关系数(r2)达到0.99。如部分样品含量仍超出线性范围，需将样液适当稀释，再进行定量。

2.2色谱条件的优化

甲醇在APCI模式下容易电离，通常是最佳的强洗脱溶剂。实验采用水+甲醇溶液作为流动相，并在甲醇中添加甲酸以促进电离，增强信号响应。在0.01%～0.05%范围内对甲酸含量进行优化，结果表明，随着甲酸含量的增加，维生素的响应增加，添加0.02%甲酸时各维生素的响应比不添加甲酸时增加20%～50%，继续增加甲酸含量，响应增加不显著，且维生素E的基线明显抬高，因此最终选择向甲醇中添加0.02%的甲酸。

APCI模式下增加流动相流速可以提高响应，实验比较发现，在0.2～0.4 mL/min流速范围内，流速越大，各维生素的响应越高，0.4 mL/min流速比0.2 mL/min的响应提高50%～120%，但继续增加流速，响应提高不明显，而液相色谱系统的反压增加显著，因此最终选择流速为0.4 mL/min。

由于各脂溶性维生素的极性差别较大，维生素A的极性相对较强，容易洗脱，维生素E和K1的极性较弱，较难洗脱，因此采用梯度洗脱，可缩短分析时间同时获得较好的分离效果。在“1.2”所述梯度洗脱程序下，各维生素达到了良好的分离。某婴儿配方奶粉样品的定量离子选择离子流图见图1。

2.3样品提取条件的优化

参考GB 5413.9-2010中维生素A、D、E的测定条件[1]进行提取时，维生素K1的损失较大，回收率不到10%。参考GB 5413.10-2010中维生素K1的测定条件[2]，K1的提取效率可提高至80%，但维生素A、D和E的提取率均降低，仅为50%～60%。结合两个方法，先酶解，再加KOH溶液，加温皂化一段时间后，A、D和E的提取效率为70%～80%，K1的提取效率为50%左右；减少KOH溶液用量可以提高K1的提取效率，但会导致皂化不完全，使维生素E测定值偏低。由于采用同位素内标法校正，50%的提取效率不影响样品的准确定量。

2.4线性范围与定量下限

用水-乙醇(2∶8)配制系列浓度的各维生素标准溶液，采用本方法进行测定，以标准溶液中维生素的质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，某维生素峰面积与相应同位素内标的峰面积比值(Y)为纵坐标作图。各维生素的线性回归方程、相关系数(r2)、线性范围见表2。取空白脱脂奶粉样品，按“1.4”方法处理后添加维生素混合标准溶液，以10倍信噪比(S/N=10)确定各维生素的定量下限，结果见表2。各脂溶性维生素在一定质量浓度范围内具有良好的线性，相关系数(r2)均大于0.99，定量下限为0.5～10 μg/100 g。本方法灵敏度较高，满足配方奶粉中脂溶性维生素的测定要求。

VitaminLinearrange(μg/mL)r2RegressionequationLOQ(μg/100g)A0.1～100.9927Y=9.9397X+0.580261.0D20.005～0.50.9981Y=17.626X+0.0132160.5D30.005～0.50.9987Y=10.508X+0.00576320.5E1～1000.9994Y=0.26666X+0.04558610K10.025～2.50.9987Y=75.085X+0.0440441.0

2.5回收率与相对标准偏差

脂溶性维生素在奶粉中天然存在，无绝对空白的样品做标准添加实验，因此选择各维生素含量较低的样品进行加标实验。比较了与配方奶粉接近的脱脂奶粉、全脂奶粉、甜乳清粉、脱盐乳清粉等样品基质，发现脱脂奶粉中各维生素的含量最低。根据空白样品及配方奶粉样品的维生素含量，设定维生素的添加水平为：维生素D2、D3为5，10，20 μg/100 g，维生素A为100，200，400 μg/100 g，维生素E为1 000，2 000，4 000 μg/100 g，维生素K1为25，50，100 μg/100 g，每个水平重复实验6次，加标回收率及相对标准偏差(RSD)见表3,其平均回收率为83.8%～113.7%，RSD为1.2%～10.1%。方法显示了较好的回收率与精密度。

表3　6种脂溶性维生素的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

*no detected

表4　标准参考物1849a的测定结果

*not certified,**no detected

2.6标准参考物的测定

为进一步评价方法的准确性，采用本方法测定了NIST的奶粉标准参考物SRM 1849a，结果见表4，测定结果均在定值范围内，6次平行测定的RSD为2.0%～5.7%，重复性较好。

2.7实际样品测定

采用本方法对天津口岸120批进口及9个国产婴幼儿配方奶粉进行了测定，结果显示样品中各脂溶性维生素含量均符合国家标准的规定。

3结论

本研究建立了同时测定婴幼儿配方奶粉中维生素A、维生素D2、维生素D3、维生素E和维生素K1的同位素稀释/液相色谱-串联质谱分析方法。方法的定量下限为0.5～10 μg/100 g，回收率为83.8%～113.7%。本方法具有高通量、简便、灵敏、准确的特点，能满足国内外相关婴幼儿配方奶粉产品中维生素含量的检测要求，便于进行脂溶性维生素水平的监控，有利于提高婴幼儿配方奶粉的安全性。

参考文献：

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[2]GB 5413.10-2010.Determination of Vitamin K1in Foods for Infants and Young Children,Milk and Milk Products.Chinese National Food Safety Standard(婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定.中华人民共和国食品安全国家标准).

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研究简报

摘要：采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS) 结合同位素稀释定量方法，建立了婴幼儿配方奶粉中维生素A、维生素D2、维生素D3、维生素E和维生素K15种脂溶性维生素同时测定的分析方法。样品经脂肪酶酶解，氢氧化钾-乙醇皂化，石油醚提取，乙醇定容，经BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分离后，以甲醇(甲酸0.02%)-0.1%甲酸溶液为流动相，0.4 mL/min梯度洗脱，采用大气压化学电离，正离子多反应监测模式测定。5种脂溶性维生素在一定浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数(r2)大于0.99，加标回收率为83.8%～113.7%，相对标准偏差(RSD，n=6)为1.2%～10.1%，定量下限(LOQ)为0.5～10 μg/100g。该方法简便、快速、灵敏、准确，可满足配方奶粉中脂溶性维生素的检测要求。

关键词：同位素稀释；液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；脂溶性维生素；维生素A；维生素D；维生素E；维生素K1；测定

Determination of Fat Vitamins in Infant Formula Milk by Isotope Dilution/High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryZHAO Kong-xiang*,LOU Ting-ting,HE Jia,CHEN Qi-yong,GE Bao-kun，ZHENG Wen-jie

(Tianjin Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin300461,China)

Abstract：A liquid chromatography-tandem mass spectrometric method(LC-MS/MS) was developed for the determination of content of vitamin A,vitamin D2，vitamin D3，vitamin E and vitamin K1in infant formula milk.The fat vitamins were extracted with petroleum ether after enzymatic hydrolysis and saponification.The chromatographic separation was completed with the column of BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) using methanol(0.02% formic acid)-0.1% formic acid solution as mobile phase.Ionization mode was positive atmospheric pressure chemical ionization(APCI).Mass spectrometry data was acquired by multiple reaction monitoring(MRM) mode.The quantification analysis was carried out by isotope dilution method(each vitamin had its isotope internal standard).The calibration curves of 5 fat vitamins were linear in the certain concentration ranges with correlation coefficients(r2) above 0.99.The recoveries at three spiked levels(low,middle and high) ranged from 83.8% to 113.7% with relative standard deviations(RSD,n=6) of 1.2%-10.1%.The quantitation limits were in the range of 0.5-10 μg/100 g.The method was rapid,easy,accurate and sensitive,and could be used to detect fat vitamins in infant formula milk.

Key words：isotope dilution;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) ;fat vitamin;vitamin A;vitamin D;vitamin E;vitamin K1;determination

中图分类号：O657.63；O629.4

文献标识码：A

文章编号：1004-4957(2015)12-1372-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.007

通讯作者：*赵孔祥，高级工程师，研究方向：食品残留分析，Tel：022-66703154，E-mail：wwwkongxiang@163.com

基金项目：天津出入境检验检疫局科研资助项目(TK081-2013)

收稿日期：2015-05-19；修回日期：2015-06-23