高效液相色谱-串联质谱法测定卷烟中的甘草酸

秦艳华，庄亚东，张　华，韩开冬，石怀彬，尤晓娟，刘献军

(江苏中烟工业有限责任公司　技术研发中心，江苏　南京　210019)



高效液相色谱-串联质谱法测定卷烟中的甘草酸

秦艳华，庄亚东，张华，韩开冬，石怀彬，尤晓娟，刘献军*

(江苏中烟工业有限责任公司技术研发中心，江苏南京210019)

甘草酸是甘草中含有的三萜类物质，其钾、钙盐是甘草的主要甜味成分，具有抗炎[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]、促进脂肪代谢[4]等作用，被用作多种保健食品和药品的原料[5-6]，同时也可用作食品添加剂[7]。甘草用作烟草制品的添加剂已有一百多年历史，其添加方式以浸膏、甘草粉、酊剂等为主。合理控制甘草成分在卷烟中的用量，可在柔和卷烟烟气、提调烟香、掩盖杂气以及降低烟气对鼻腔、口腔及咽喉部粘膜的刺激等方面发挥重要作用。高纯度的甘草酸也可用作烟草添加剂，具有较强的增香效果，同时还有一定的保润作用[8]。烟叶本身并不含甘草酸，而甘草酸在高强度加工过程中理化性质稳定(沸点高于1 000℃)，因此其含量的变化情况可以作为评价卷烟制丝工序加料均匀性的重要指标之一。加香加料的均匀性是影响卷烟产品质量稳定性的重要因素，目前国内在加香加料均匀性方面开展了一些研究，如以1,2-丙二醇或乙基麦芽酚为标记物，评价施加料液的均匀性[9-11]。但1,2-丙二醇和乙基麦芽酚的沸点低于300 ℃，在制丝工序高强度加工过程中存在较大的损耗。因此，准确测定卷烟中的甘草酸含量，对烟草的品质评价和指导准确加料具有重要意义。

甘草酸为甘草的主要成分[12]，其测定方法的研究主要集中在医药、天然产物化学等领域，包括比色法[13-14]、薄层扫描法[15]、高效毛细管电泳[16]、液相色谱法[17-20]、液相色谱-质谱法[21-22]、CdSe量子点荧光增敏法[23]等。田忠等[24]采用高效液相色谱-紫外检测器测定了白肋烟中的甘草酸含量，但由于卷烟成分复杂，存在基质干扰，方法的选择性和灵敏度不高，因此难以满足应用甘草酸评价加料均匀性所要求的准确度。高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)具有高选择性、高灵敏度的特点,而应用该方法分析卷烟中的甘草酸含量尚未见报道。因此，本文拟应用HPLC-MS/MS建立卷烟中甘草酸含量的分析方法，以期为卷烟制丝工序加料均匀性评价提供必要的技术支持[12,24-25]。

1实验部分

1.1仪器与试剂

API 3200型三重四极杆串联质谱仪(美国Applied Biosystems公司);1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；HY-5回旋振荡器(常州国华电器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；ME204电子天平(感量0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司)。

甘草酸单铵标准品(纯度≥95%，美国Sigma公司)；甲醇(色谱纯,德国CNW公司)；醋酸铵(色谱纯，美国Sigma公司)；实验用水为Milli-Q超纯水仪制备的超纯水。

1.2标准溶液的配制

标准储备液：准确称取5.0 mg甘草酸单铵盐标准品，用甲醇配制成浓度为0.05 mg/mL的标准储备溶液。

标准工作溶液：准确移取0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL标准储备液，分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到质量浓度分别为0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.50 mg/L的甘草酸单铵标准溶液。

1.3样品前处理

烟丝样品于40 ℃下烘干2 h，粉碎，过40目筛。称取约0.250 0 g烟末(精确至0.1 mg)，置于50 mL三角瓶中，加入25.0 mL 甲醇-5 mmol/L醋酸铵(4∶1)萃取液，室温下以150 r/min振荡30 min，过滤后待测。

1.4色谱与质谱条件

液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。流动相：A为5 mmol/L醋酸铵水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～10.0 min，10%～100%B；10.0～15.0 min，100%B；15.0～15.1 min，100%～10%B；15.1～30.0 min，10%B。流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL。

质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子检测模式(ESI+)，扫描方式为多反应监测(MRM)；雾化气压力：40 psi；辅助气压力：50 psi；气帘气压力：10 psi；碰撞气压力：5 psi；离子喷射电压：5 500 V；离子源温度：350 ℃；去簇电压(DP)为55 V；射入电压(EP)为9 V；碰撞室入口电压(CEP)为28 V；碰撞室射出电压(CXP)为10 V；前体离子Q1([M(甘草酸)+H]+)：823m/z；定量、辅助定性产物离子Q3分别为452.8，647.5m/z，对应的碰撞能量为45，26 V；标准品保留时间：10.40 min。

2结果与讨论

2.1萃取溶剂的选择

甘草酸的萃取多采用甲醇-水、乙醇-水作为提取溶剂[17-18,21,24-25]，由于甘草酸在醇中的溶解度大于在水中的溶解度[18]，故以纯水为提取剂时甘草酸的提取量偏低。实验比较了纯甲醇、80%甲醇水溶液和50%甲醇水溶液分别作为萃取溶剂时的提取效率，发现80%甲醇水溶液的萃取效果最好。这是因为醇-水溶液对甘草酸的溶解性较好，对粉状样品的穿透性较强，因此提取效率较高，此结果与文献报道的结论相一致[26]。

2.2质谱条件的优化

将甘草酸单铵标准品溶于甲醇，配成浓度为1 μg·mL-1的溶液。通过注射泵连续进样，在正离子模式下进行质谱条件的优化。先进行一级质谱图全扫描，确定其准分子离子[M+H]+，然后对母离子做子离子全扫描，得到碎片离子，选择丰度较高的两个特征碎片离子分别作为定性和定量离子。最后对去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞室入口电压(CEP)、碰撞能量(CE)、碰撞室射出电压(CXP)等参数进行优化。优化后的质谱条件见“1.4”。

2.3色谱条件的优化

考察了色谱柱温度在30～40 ℃区间内对甘草酸分离效果的影响，结果显示，当柱温从30 ℃升至40 ℃时，信噪比从259.5降至237.5，保留时间变短，但分离效果无明显差别。因此，选择30 ℃作为色谱柱的分离温度。

从分析的选择性及灵敏度的角度考虑，实验采用甲醇-水体系为流动相，并在流动相中添加醋酸铵，以促进电喷雾离子源条件下化合物的离子化。考察了流动相中醋酸铵浓度分别为0,2,5,8 mmol/L时，甘草酸单铵的色谱峰形及其响应情况。结果表明，不加醋酸铵时，色谱峰峰宽较宽。加入2 mmol/L醋酸铵时，可明显改善色谱峰形且提高离子化效率。醋酸铵浓度增至5 mmol/L时，色谱峰形状和离子化效率进一步改善，但其浓度继续加大时，色谱峰形的变化不明显，且离子化效率有减小的趋势(图1)。因此实验选择含5 mmol/L醋酸铵的甲醇-水为流动相体系。

实验进一步对等度洗脱和梯度洗脱程序进行比较，采用甲醇-5 mmol/L醋酸铵(70∶30)等度洗脱时，甘草酸的保留时间为4.2 min，峰宽1.0 min；采用甲醇-5 mmol/L醋酸铵(50∶50)等度洗脱时，15.0 min内不出峰；选用梯度洗脱并优化洗脱程序后，甘草酸的保留时间增至10.4 min，峰宽0.4 min。为使化合物有较好的分离和适当的出峰时间，最终选择梯度洗脱。图2为甘草酸单铵标准品和卷烟样品的提取离子色谱图。

2.4工作曲线、检出限及定量下限

采用本方法对“1.2”中系列浓度标准工作溶液进行测定，外标法定量，以甘草酸的峰面积(Y)对其浓度(X，mg/L)进行回归分析，得线性方程为Y=4.82×104X-336，r2=0.999 4。表明甘草酸在0.05～2.50 mg·L-1浓度范围内线性关系良好。基于取样量及样品萃取溶液体积，以3倍信噪比确定方法的检出限(LOD)为1.4 mg/kg，10倍信噪比确定方法的定量下限(LOQ)为4.8 mg/kg。

2.5加标回收率与相对标准偏差

取烟末样品，分别添加浓度为100 μg·mL-1的标准溶液40，80，120 μL，即加标水平分别为16，32，48 mg·kg-1，按照本方法进行样品前处理和测定，每个加标水平平行测定6次。日内精密度通过1 d内测定3个加标水平下的6个平行得到，日间精密度由连续6 d(每天测定1次)测定3个加标水平下的样品得到，结果见表1。由表1可知，方法的加标回收率为89.1%～105.0%，日内相对标准偏差(RSD)为0.8%～3.0%，日间RSD为3.8%～5.0%。表明方法具有较好的准确度与精密度。

表1　方法的回收率与相对标准偏差(n=6)

2.6HPLC与LC-MS/MS法的比较

本实验就方法的灵敏度和选择性两个方面对HPLC和LC-MS/MS进行了比较，两个方法所采用的色谱条件完全一致。由表2可知，LC-MS/MS方法的检出限、定量下限低于HPLC法，且相同浓度标准溶液(1.0 μg·mL-1)的信噪比是HPLC的300多倍，灵敏度明显高于HPLC法。由于HPLC法(波长252 nm)的选择性较差，样品峰受到杂质峰的影响无法实现基线分离，且所测卷烟产品中甘草酸的含量低(低于HPLC定量下限)，因此在同样前处理条件下不能用该方法进行定量分析。LC-MS/MS方法由于选择性强，无杂质峰干扰，可以达到基线分离。所以，相比于HPLC方法，LC-MS/MS方法更能满足检测要求。

表2　HPLC与LC-MS/MS法的比较

2.7实际样品的测定

采用本文所建立的方法，测定了1种市售卷烟10个批次样品中甘草酸的含量，其检出结果为31.19～34.17 μg/支，RSD为4.5%。该品牌卷烟中甘草酸的含量较为稳定，加料均匀性较好。

3结论

本文建立了检测卷烟中甘草酸含量的HPLC-MS/MS方法，通过对色谱条件的优化，显著提高了检测灵敏度；利用串联质谱高选择性的特点，有效去除了基质成分的干扰，保证了方法的灵敏度。方法检出限为1.4 mg/kg，加标回收率为89.1%～105.0%，日内RSD为0.8%～3.0%，日间RSD为3.8%～5.0%。方法的准确度好，样品通量较高，适用于卷烟产品中甘草酸含量的分析，尤其适用于卷烟制造过程控制的大规模样品检测。

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摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定卷烟中甘草酸的分析方法。采用甲醇-5 mmol/L醋酸铵水溶液(4∶1)为萃取溶剂，经Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)分离后，串联质谱多反应离子监测模式(MRM)检测，外标法定量。甘草酸在0.05～2.50 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数大于0.999 4，方法的定量下限为4.8 mg/kg；回收率为89.1%～105.0%，日内、日间相对标准偏差(RSD)均不大于5%。

关键词：高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)；卷烟；甘草酸

Determination of Glycyrrhizic Acid in Cigarette by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryQIN Yan-hua,ZHUANG Ya-dong,ZHANG Hua,HAN Kai-dong,SHI Huai-bin,YOU Xiao-juan,LIU Xian-jun*

(Research & Development Center,China Tobacco Jiangsu Industrial Co.,Ltd.,Nanjing210019,China)

Abstract：A new method was developed for the determination of glycyrrhizic acid in cigarette by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The samples were extracted with methnol-5 mmol/L NH4Ac(4∶1) under oscillation,then separated on an Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column(2.1 mm×150 mm，3.5 μm).The glycyrrhizic acid was detected with HPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified by the external standard method.The method had a good linearity(r2>0.999) in the concentration range of 0.05-2.50 mg/L.The recoveries of glycyrrhizic acid were in the range of 89.1%-105.0% with intra-day and inter-day relative standard deviations both not more than 5%.The limit of quantitation(LOQ) of method was 4.8 mg/kg.

Key words：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);cigarette;glycyrrhizic acid

中图分类号：O657.63;TS202

文献标识码：A

文章编号：1004-4957(2015)12-1398-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.012

通讯作者：*刘献军，硕士,工程师，研究方向：烟草化学分析及卷烟烟气分析，Tel：025-86478506，E-mail：liuxj@jszygs.com

基金项目：中国烟草总公司增香保润重大专项“HXD对料液施加效果的影响研究”(110201301027(BR-12)

收稿日期：2015-05-14；修回日期：2015-07-20