白藜芦醇对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制探讨

李凌云，霍红梅，高芦燕，宋锴，王爱东

(苏州大学附属第二医院，江苏苏州215004)



白藜芦醇对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制探讨

李凌云，霍红梅，高芦燕，宋锴，王爱东

(苏州大学附属第二医院，江苏苏州215004)

摘要：目的观察白藜芦醇(Res)对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用，并探讨其作用机制。方法40只SD大鼠分别予普通饲料喂养16只(对照组、空白组各8只)和高脂高糖饲料喂养24只，喂养8周后高脂高糖喂养的大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg制作2型糖尿病模型，取16只随机分为观察组、模型组各8只。观察组和对照组予10 mg/(kg·d) Res，模型组和空白组予等量的1%羧甲基纤维素钠，每日灌胃1次，连续8周。比较各组空腹血糖(FBG)、TG、TC、肾脏质量指数(Kw/Bw)、24 h尿蛋白定量。PAS染色观察肾脏组织病理学变化，免疫组化法检测肾脏组织CD68和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3和磷酸化Smad3蛋白。结果观察组24 h尿总蛋白、FBG、TC、TG、Kw/Bw均低于模型组，P均<0.01；模型组24 h尿总蛋白、FBG、TC、TG、Kw/Bw均高于空白组、对照组，P均<0.01。肾脏组织病理改变为观察组轻于模型组，模型组重于空白组、对照组。观察组肾脏组织α-SMA、CD68的表达均低于模型组，P均<0.01；模型组肾脏组织α-SMA、CD68表达均低于空白组、对照组，P均<0.01。观察组TGF-β1、磷酸化Smad3蛋白的相对表达量明显低于模型组、对照组，P均<0.01；模型组TGF-β1、磷酸化Smad3蛋白的相对表达量明显低于空白组，P均<0.01。结论Res对2型糖尿病大鼠的肾脏功能有保护作用，可能与抑制TGF-β1/ Smad3信号通路有关。

关键词：白藜芦醇；2型糖尿病；糖尿病肾病；转化生长因子β1；Smad3蛋白

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要并发症，是发达国家终末期肾脏疾病的最常见病因，我国DN发病率逐年上升。探讨DN发病的分子机制，寻找DN治疗的靶点，对于开发新型DN治疗药物、控制和延缓DN的发展进程具有重要意义。肾小管间质纤维化是DN发展至终末期肾脏病的主要病理改变。转化生长因子β1(TGF-β1)是肾脏纤维化发生、发展的核心因子[1,2]。Smad依赖的信号通路是传导TGF-β信号的主要途径，DN患者肾脏组织中可见Smad2、Smad3的表达水平均明显升高[3，4]。白藜芦醇(Res) 是一种多酚化合物，广泛存在于葡萄、花生及虎杖等植物中，具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎、抗氧化、保肝、保护神经系统等多种药理学作用[5,6]。近年研究发现，Res能改善糖尿病大鼠肾脏炎性损伤，但其治疗DN的作用机制尚不明确。2014年3～12月，我们观察了Res对2型糖尿病大鼠的肾保护作用，并探讨其分子机制。现报告如下。

1材料与方法

1.1材料健康雄性4周龄清洁级SD大鼠40只，体质量90～100 g，由苏州大学医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK(苏)2012-0045 。高脂高糖饲料配方:猪油 10%、蛋黄粉10%、胆固醇2.5%、胆酸钠0.05%、蔗糖20%、普通饲料57.5%。链脲佐菌素(STZ);Res(纯度>98%, 上海同田生物)，用质量分数1%的羧甲基纤维素钠配制成混悬液后备用;ABC检测试剂盒和DAB显色试剂盒(Vector Laboratories); 抗体α-SMA(1∶100, Santa-cruz);CD68(1∶100，Abcam);TGF-β1(1∶1 000;Santa-cruz);Smad3(1∶1 000，Cell signaling)。OneTouch血糖仪(美国强生医疗器材有限公司)；正置显微镜(Scope A1，德国Zeiss)，蛋白电泳仪(美国Bio-rad)。

1.2动物分组与干预40只SD大鼠，分别予普通饲料(16只)、高脂高糖饲料(24只)喂养8周。高脂高糖饲料喂养的大鼠一次性腹腔注射STZ 40 mg/kg制作2型糖尿病模型；注射后72 h尾静脉测定空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且1周稳定者为造模成功；随机选取16只分为观察组和模型组各8只。普通饲料喂养者空腹予注射等量枸橼酸缓冲液，随机分为对照组和空白组各8只。观察组和对照组予10 mg/(kg·d) Res，模型组和空白对照组予等体积质量分数为1%羧甲基纤维素钠，每日上午灌胃给药1次，连续8周。

1.3糖脂及肾功能指标检测末次给药后收集各组24 h尿液，采用磺基水杨酸法检测24 h尿总蛋白。禁食不禁水12 h后，抽取尾静脉血3 mL检测FBG。称量大鼠体质量，心脏取血，分离血浆，采用全自动生化分析仪检测血脂指标TC、TG。乙醚麻醉大鼠，腹主动脉插管灌注4 ℃预冷PBS冲洗肾脏去除血液，取双肾，剥离包膜，称重，计算肾脏质量指数(肾质量/体质量，Kw/Bw，mg/g)。

1.4肾脏组织病理观察取1/2左肾组织，用 4%多聚甲醛固定，其余肾脏放入液氮速冻后-80 ℃保存备用。取部分肾脏组织，常规石蜡包埋，4 μm切片；脱蜡后行过PAS染色，光镜下观察各组大鼠肾脏组织病理。

1.5肾脏组织α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD68检测 取各组肾脏组织，切片脱蜡，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶；0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中煮沸30 min，进行抗原修复，采用免疫组化法检测各组肾脏组织α-SMA和CD68表达。操作均严格按照使用说明书进行。α-SMA和CD68阳性表达均呈黄褐色。各组随机选取30个视野采集图像，用图像分析软件Image Pro Plus 6.0测量α-SMA、CD68的阳性区域所占整个图像的面积比来表示α-SMA和CD68的表达。

1.6肾脏组织TGF-β1、Smad3和磷酸化Smad3蛋白检测取各组部分肾脏组织，采用Western blot法检测各组肾脏组织TGF-β1、Smad3和磷酸化Smad3蛋白表达。以β-actin(1∶10 000)作为内参，实验重复3次。Image J软件分析各蛋白表达条带的光密度值，以空白组的条带光密度值为100%，进行半定量分析比较。

2结果

2.1各组24 h尿总蛋白、FBG、TC、TG和Kw/Bw比较见表1。

2.2各组肾脏组织病理镜下可见，空白组和对照

表1　各组24 h尿总蛋白、FBG、TC、TG和Kw/Bw比较

注：与空白组、对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.01。组大鼠肾脏组织结构均无明显异常。与空白组、对照组比较，模型组肾小球体积增大，基底膜增厚，系膜细胞增生，细胞外基质(ECM)增多，毛细血管壁节段性增厚硬化，肾小囊粘连，肾小管排列紊乱，偶有肾小管萎缩闭塞，间质血管壁增厚。观察组上述病理改变较模型组减轻。

2.3各组肾脏组织α-SMA和CD68表达比较见表2。

表2　各组肾脏组织α-SMA和CD68表达

注：与空白组、对照组比较，*P< 0.01;与模型组比较，#P<0.01。

2.4各组肾脏组织TGF-β1、Smad3和磷酸化Smad3蛋白表达见表3。

表3　各组肾脏组织TGF-β1、Smad3和磷酸化Smad3

注：与空白组、对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.01。

3讨论

DN的发病机制十分复杂，糖脂代谢紊乱是其主要致病基础[7]。研究发现，DN大鼠肾脏组织中TGF-β1mRNA与蛋白表达水平明显增加[8～10]。TGF-β1是许多细胞因子导致肾脏损伤最终的共同信号通路，可促进细胞肥大、ECM积聚，进一步导致肾小球硬化和肾脏广泛纤维化[11]。与配体结合后，TGF-β家族受体激活由 Smad 蛋白家族介导的信号转导通路。Smad2和Smad3是受体调节型Smad蛋白，可以被受体磷酸化而被激活。磷酸化Smad2和Smad3是TGF-β1途径下游的重要信号，Smad2/3 被磷酸化后转位至细胞核，作用于靶基因，在转录水平调控α-SMA的表达，促进肾小管上皮细胞向成纤维细胞转化，介导间质纤维化和肾小球硬化[12]。此外，TGF-β1还诱导淋巴细胞和巨噬细胞浸润于肾间质，诱发肾组织的慢性炎症反应，促进肾小管间质纤维化。

Res是一种天然多酚类物质。研究表明，Res可控制高热量饮食引起的动物体质量增加，减轻胰岛素抵抗水平，改善高脂饲养大鼠的肾脏功能，可能与其抗氧化、抑制NF-κB 活性、降低单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达有关[13]。此外，Res可下调糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、Smad2 mRNA的表达[14]。Res既能激活过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)，也可激活PPARα[15]。研究发现，长期使用PPARα激动剂可减轻2型糖尿病动物的肾小球肥大和系膜基质增生，改善肾脏结构和功能，主要作用机制为阻断NF-κB和TGF-β1/Smad3[16]。Res能抑制TGF-β/Smad和ERK1/2信号途径，缓解STZ诱导的1型糖尿病大鼠早期肾损伤[17]。

本研究结果显示，观察组24 h尿总蛋白、FBG、TC、TG、Kw/Bw均低于模型组，提示Res可改善高血糖、高脂血症，对肾脏有保护作用，减轻糖尿病早期微血管病变。同时,长期服用Res对正常大鼠肾功能和组织结构无明显影响，与以往研究结果[18，19]一致。细胞因子MCP-1在肾脏中主要分布于肾小球系膜细胞、内皮细胞及肾小管上皮细胞，其作用主要是募集单核-巨噬细胞在肾组织聚集[20]。本研究发现，模型组肾脏组织中有大量CD68阳性细胞，提示存在巨噬细胞浸润，主要累及肾小管间质和部分肾小球系膜；Res可显著减轻CD68阳性细胞浸润，还能减少糖尿病大鼠肾小管间质和肾小囊周围的α-SMA聚积表达，表明Res可通过抑制肾小管上皮细胞分化为成纤维细胞，改善肾组织纤维化。本研究还发现，Res可减少糖尿病大鼠肾组织TGF-β1表达量，降低糖尿病大鼠肾组织Smad3磷酸化水平，提示Res可能通过抑制TGF-β1分泌和Smad3活化，抑制TGF-β1/Smad3信号转导通路，减轻糖尿病大鼠肾脏细胞的损伤、肾组织的炎症反应和间质纤维化。

综上所述，Res可降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂，减少糖尿病大鼠肾脏组织巨噬细胞浸润，抑制TGF-β1/Smad3信号通路，抑制肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞，缓解肾脏组织炎症反应和纤维化，发挥肾脏保护作用。

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Renal protection of resveratrol on type 2 diabetic rats and the mechanism

LILing-yun,HUOHong-mei,GAOLu-yan,SONGKai,WANGAi-dong

(TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215004,China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of resveratrol (Res) on the kidney of rats with type 2 diabetes mellitus and to explore the underlying mechanism. MethodsDuring 40 SD rats, 16 rats were fed with normal diet (control group and blank group, 8 rats in each group) and 24 rats were fed with high- fat diet for 8 weeks, and then 40 mg/kg streptozotocin (STZ) were injected into the 24 rats to make the type 2 diabetes mellitus models. After that, 16 model rats were selected and were randomly divided into the observation group and model group. Rats in the observation group and control group were treated with 10 mg/(kg · d) Res intragastrically and the model group and blank group with the same volume of 1% sodium carboxymethyl cellulose, once a day and for 8 weeks. The fasting blood glucose (FBG), blood lipid (TG), cholesterol (TC), kidney weight/body weight (Kw/Bw) and 24 h urine protein were assayed, and the pathologic changes of renal tissues were observed. The expression of CD68 and α-SMA was detected by immunohistochemistry. The expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1), Smad3 and phospho-Smad3 was detected by Western blotting. ResultsThe 24 h urine protein, FBG, TC, TG and Kw/Bw of the observation group were lower than those of the model group (all P<0.01). The 24 h urine protein, FBG, TC, TG and Kw/Bw of the model group were higher than those of the blank group and the control group (all P<0.01). The pathologic changes of kidney tissues in the observation group were less than those of the model group, and the model group was more than that of the blank group. The expression of α-SMA and CD68 in the kidney tissues of the observation group was lower than that of the model group (all P<0.01), and the expression of α-SMA and CD68 in the kidney tissues of the model group was lower than that of the blank group and the control group (all P<0.01). The expression of TGF- β1and phospho-Smad3 in the observation group was lower than that of the model group (all P<0.01), and the expression of TGF-β1and phospho- Smad3 in the model group was lower than that of the blank group and the control group (all P<0.01).ConclusionRes protects the kidney function of type 2 diabetic rats, which may be related to the inhibition of TGF-β1/Smad3 signaling pathway.

Key words:resveratrol; type 2 diabetes mellitus; diabetic nephropathy; transforming growth factor -β1； Smad3 protein

收稿日期：(2015-08-05)

通信作者简介：王爱东(1968- )，女，博士，主任技师，主要研究方向为分子诊断学。E-mail： eagle.wangad@163.com

作者简介：第一李凌云(1978- )，女，硕士，助理研究员，主要研究方向为分子药理学。E-mail： lingyunlee@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81200495)。

中图分类号：R966

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)46-0004-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.002