黄芪甲苷对心肌细胞保护作用的研究进展

陈靖宇，陈铁龙

1.浙江中医药大学(杭州 310000)，E-mail：532688835@qq.com；2.浙江省杭州市中医院



黄芪甲苷对心肌细胞保护作用的研究进展

陈靖宇1，陈铁龙2

1.浙江中医药大学(杭州 310000)，E-mail：532688835@qq.com；2.浙江省杭州市中医院

摘要：心血管系统疾病是威胁人们生命的重要疾病，其发生机制较复杂，其中心肌细胞凋亡机制是近年来研究的热点。对于心肌细胞的保护，黄芪甲苷(As-Ⅳ)起到巨大的作用，它的作用有不同的机制。本研究就As-Ⅳ对心肌细胞的保护作用及机制方面进行相关论述。

关键词：心血管系统疾病；黄芪甲苷；心肌细胞；凋亡；黄芪

黄芪甲苷 (Astragaloside Ⅳ，As-Ⅳ)是中药材黄芪 (Astragalus membranaceus) 的重要有效化学成分之一[1]。它的主要药理作用包括增强免疫力、抗炎[2]、抗氧化[3-4]、抗病毒等[5]。近年来，该中药单体对心血管系统的作用日益受到人们的重视[6]。以As-Ⅳ为主要成分的黄芪注射液主要用于病毒性心肌炎、心力衰竭等[7-8]，提示As-Ⅳ 可能具有类似强心苷类药物的正性肌力作用。近年来相继开展了As-Ⅳ在保护心肌细胞方面的研究，包括As-Ⅳ对相关心血管方面疾病的保护作用以及作用的机制，本研究就相关内容作一综述。

1As-Ⅳ对维持心肌细胞内钙稳态起作用

龚奥娣等[9]探讨As-Ⅳ对心肌缺血心律失常模型大鼠心肌细胞 Ca2+浓度的影响，将心肌缺血再灌注模型大鼠随机分为模型组和假手术组，各组给药7 d后开始造模。将 Fura- 2/AM 荧光探针负栽于大鼠心肌细胞，采用荧光分光光度计检测Ca2+浓度。结果显示模型组心肌细胞内游离Ca2+浓度与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；与As-Ⅳ的低剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与As-Ⅳ的中、高剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；As-Ⅳ的中、高剂量组与普罗帕酮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本实验证明As-Ⅳ可降低心肌细胞内游离Ca2+浓度，从而减少心律失常的发生，起到抗心律失常的作用。赵美眯等[10]研究As-Ⅳ对豚鼠心室肌细胞 L型钙电流和细胞内钙的影响，分离单个豚鼠心室肌细胞，应用全细胞膜片钳技术测定钙电流，并采用荧光显微镜CCD成像系统动态观察细胞内钙变化。结果：1×10-6mmol/L As-Ⅳ可明显抑制L-型钙通道电流(ICa-L)，使最大电流峰值降低32.6%。As-Ⅳ对60 mmol/L的KCl诱导的[Ca2+]i升高有抑制作用，最大荧光密度变化值从1.17±0.30降至0.26±0.16(P<0.05)。并且As-Ⅳ可直接促进钙池内钙释放，使[Ca2+]i从0.08±0.02升高到0.23±0.07(P<0.05)。从而得出结论：As-Ⅳ抑制 L型钙通道，可减少细胞外钙内流；同时它促进内钙释放，对心肌细胞内钙稳态表现为双向调节作用。王秋宁等[11]探讨As-Ⅳ对异丙肾上腺素(Iso)诱导的乳大鼠心肌细胞肥大的保护作用和机制。实验方法：将体外培养的乳大鼠心肌细胞分别加入As-Ⅳ3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L和90 μmol/L孵育30 min后，再加入Iso10 μmol/L作用48 h。另设As-Ⅳ30 μmol/L和Iso30 μmol/L模型对照组。用考马斯亮蓝法测定心肌细胞总蛋白含量；消化分离法及计算机图像分析系统测量细胞体积；MTT法测定细胞存活率；以Fura-2/AM为荧光探针，采用Till阳离子测定系统，观察胞内[Ca2+]i瞬间变化。结果与正常对照组相比，As-Ⅳ30 μmol/L对心肌细胞无影响；Iso 30 μmol/L可使心肌细胞总蛋白含量明显增加，体积明显增大，心肌细胞内[Ca2+]i瞬间峰值增大，同时使心肌细胞存活率降低了48.1%(P<0.01)。与Iso模型组相比，预加入As-Ⅳ10 μmol/L和30 μmol/L的心肌细胞蛋白质含量明显降低，As-Ⅳ30 μmol/L组可以恢复达到正常对照组水平；As-Ⅳ 3 μmol/L～90 μmol/L可以拮抗Iso对正常心肌细胞体积增大、细胞内[Ca2+]i瞬间变化幅度增大的作用；As-Ⅳ 3 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L可显著升高细胞存活率(P<0.01)。实验证明As-Ⅳ对Iso诱导的乳大鼠心肌细胞肥大有良好的保护作用，其机制可能与降低细胞内[Ca2+]i有关。

2As-Ⅳ的抗氧化反应

血浆中血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性间接反映心肌细胞膜的完整性和心肌损伤程度的改变[12-13]，LDH、CK-MB含量越高心肌损伤越明显。心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)是心肌组织中清除自由基的酶，而丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应生成的活性物质，SOD活性的降低以及MDA的生成增加均可导致心肌细胞的损害。李真真等[14]对As-Ⅳ对大剂量异丙肾上腺素 (Iso)诱导的大鼠心肌梗死的保护作用做了相关研究。用皮下注射大剂量Iso 建立大鼠心肌梗死动物模型，以心电图ST段抬高值作为心肌缺血指标。行心导管检查，观察不同剂量As-Ⅳ对大鼠血流动力学指标的影响；测定LDH、CK-MB含量，SOD 和MDA水平；并且观察心肌组织形态学改变。实验完成后与模型组比较，不同剂量As-Ⅳ均能明显改善大鼠心肌梗死血流动力学指标(P<0.05或P<0.01)，降低血清LDH、CK-MB含量(P<0.01)，提高心肌组织中SOD活性(P<0.05或P<0.01)，并可减少MDA生成(P<0.01)，减轻心肌细胞的病理形态学改变。证明As-Ⅳ对Iso 诱导的大鼠心肌梗死有保护作用，并表明As-Ⅳ对梗死心肌大鼠具有清除自由基、减轻脂质过氧化反应的能力，通过清除自由基、减轻脂质过氧化反应产生心肌保护作用。

3As-Ⅳ可以改善心肌能量代谢

线粒体是细胞能量产生和供应的主要场所，其生理功能依赖于内膜的化学电势，而这个化学电势是由线粒体膜电位和pH梯度共同构成，其中线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的稳定对于维持该化学电势起主要作用，因此，MMP可以被单独用来衡量线粒体的产能状态。张晶等[15]观察黄芪甲苷对大鼠腹主动脉缩窄所致心肌肥厚的抑制作用及对心肌能量代谢的影响。使用腹主动脉缩窄法制备大鼠心肌肥厚模型，40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪甲苷高剂量组[5 mg/(kg·d)]和低剂量组[1 mg/(kg·d)]，术后1周开始腹腔注射给药，至12周后处死。检测大鼠全心质量指数(HMI)、左心质量指数(LVMI)；取左心室组织进行HE染色，测量细胞横径(TDM)；RT-PCR法检测心肌组织心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表达。紫外分光光度法检测心肌组织中乳酸(IA)和游离脂肪酸(FFA)含有量；激光共聚焦显微镜定量检测线粒体膜电位。结果：与假手术组相比，模型组HMI和LVMI显著增加，左心室细胞横径增加29%，ANP mRNA的表达明显上调；乳酸与游离脂肪酸含有量显著升高，MMP下降了39%。与肥厚模型组相比，高剂量黄芪甲苷组大鼠心脏HMI、LVMI下降，TDM明显降低，明显下调ANP mRNA的表达；心肌组织乳酸与游离脂肪酸含有量显著降低，心肌细胞MMP上升了60%。黄芪甲苷低剂量组各项指标改变均无统计学意义。总之，高剂量的As-Ⅳ具有抑制心肌肥厚，改善心肌能量代谢的作用。

4As-Ⅳ可以抑制细胞凋亡

钟飞等[16]探讨黄芪甲苷对阿霉素诱导的心肌损伤的保护作用及其机制，雄性SD大鼠分3组：正常组、模型组和黄芪甲苷处理组；除正常组外，其余各组尾静脉注射阿霉素2.5 mg/kg，隔天1次，共6次，黄芪甲苷处理组同时给予黄芪甲苷30 mg/kg，连续2周。2周后用BL-420E生物机能实验系统采集心内压并分析心功能，检测心肌组织MDA、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性。常规病理切片，光镜观察，western-blot检测心肌组织死亡结构域相关蛋白(Daxx)的表达。结果与正常组相比，模型组左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)、SOD和GPX活性下降，MDA含量和Daxx表达升高，病理结果显示：模型组心肌细胞水肿，排列紊乱．纤维断裂，呈灶性坏死。与模型组相比，黄芪甲苷处理组左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升/下降速率、SOD和GPX活性升高，MDA含量和Daxx表达降低，病理结果显示心肌组织变性坏死显著减少。结论：黄芪甲苷能改善阿霉素心肌损伤大鼠的心功能，减轻其病理改变，其机制与其清除氧自由基、抑制细胞凋亡等作用有关。近期研究表明As-Ⅳ通过线粒体凋亡通路上PI3K/Akt信号通路的活化对心肌细胞凋亡起抑制作用。多柔比星(DOX)具有心脏毒性，线粒体介导的心肌细胞凋亡在DOX引导的心脏毒性中起决定性作用。DOX对心肌细胞的毒性可以通过增加Bax(促凋亡信号)表达或抑制Bcl-2(抗凋亡信号)表达来激活MAP[由于细胞内活性氧(ROS)过量和三磷酸腺苷(ATP)耗尽使Bax从细胞液移位至线粒体，激活而成]，这减少了Bcl-2与Bax的比例，导致了细胞色素(CytC)的释放及随后的Caspase-9与Caspase-3的激活。Jia等[17]研究黄芪甲苷对DOX引导的心肌细胞凋亡的作用，作用对象是原代培养的乳鼠。 免疫细胞化学和MTT分析：黄芪甲苷显著改善DOX引导的心肌细胞的减少，并通过恢复搏动细胞的比例和心肌细胞的搏动频率改善心功能。本质上减少了线粒体ROS的产生及LDH、CK-MB、CytC的释放。恢复了三磷酸腺苷ATP水平及SDH、ATP合酶活性(DOX引导)。这些表明了黄芪甲苷显著抑制了DOX引导的线粒体及其功能的破坏。进一步研究表明：通过Hoechst 33258染色的定性分析和流式细胞术的定量分析，黄芪甲苷显著减少了DOX引导的心肌细胞凋亡率。 Western Blot分析表明：黄芪甲苷通过引导Akt和Bad的磷酸化显著抑制线粒体凋亡通路的活性，从而恢复Bcl-2与Bax的比率，从而大大减少CytC的释放及Caspase-9与Caspase-3的激活。而PI3K的抑制剂LY294002显著抑制黄芪甲苷的抗凋亡作用。因此黄芪甲苷改善DOX引导的心脏毒性的作用必须依靠PI3K/Akt的活化。近期研究表明，As-Ⅳ通过暴露于低氧组织的脐静脉内皮细胞上的PI3K/Akt通路，成为低氧诱导因子-1a(HIF-1a)和血管生成的一个新的调节器[18]。而As-Ⅳ通过上调HIF-1a对心肌细胞的凋亡起到抑制作用[19]。

5As-Ⅳ具有抗细胞毒性作用

心肌细胞闰盘超微结构和连接蛋白43对心肌细胞有毒性损伤。姚志勇等[20]通过观察急性染镉对大鼠心肌细胞润盘超微结构和连接蛋白43(Cx43)表达的影响，探讨As-Ⅳ的保护机制。将SD大鼠随机分为正常组、镉处理组、镉加As-Ⅳ处理组，取心室肌组织，分别作光镜、透射电镜观察和免疫组化检测。结果显示与正常组相比，镉组心肌细胞连接蛋白43的表达量明显降低，心肌纤维和闰盘超微结构破坏严重；而镉加As-Ⅳ组心肌细胞连接蛋白43的表达量较镉组明显增加，心肌纤维和闰盘超微结构的损伤也明显减轻。实验表明镉能破坏心肌细胞闰盘超微结构，影响连接蛋白43的表达及分布，而As-Ⅳ能在一定程度上拮抗心肌细胞闰盘超微结构和连接蛋白43的毒性损伤。

综上所述，As-Ⅳ在保护心肌细胞上起到明显作用，且机制广泛。对于As-Ⅳ的作用机制，可能还会有更多，对于As-Ⅳ抗细胞凋亡机制方面是近期研究的热点。

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(本文编辑郭怀印)

(收稿日期：2015-11-19)

中图分类号：R965R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.018

文章编号：1672-1349(2016)09-0980-04