自由基清除剂对癫痫大鼠海马组织Fyn的亚硝基化影响

袁玉玶，郝凌云，魏学文



自由基清除剂对癫痫大鼠海马组织Fyn的亚硝基化影响

袁玉玶1，郝凌云2，魏学文1

目的研究自由基清除剂对癫痫大鼠海马组织Fyn的亚硝基化影响，并探讨其变化的可能机制。方法SD大鼠随机分为癫痫对照组(saline组)、癫痫组(KA组)和药物对照组(KA+saline组)及MCI-186组(KA+MCI-186组)。采用脑室注射海人酸制作大鼠癫痫模型。海马组织匀浆，取蛋白样品用抗Fyn抗体作免疫沉淀，然后用抗-SNO-Cys抗体做免疫印迹，检测Fyn巯基亚硝基化。结果Fyn的亚硝基化水平癫痫组和药物对照组增加(P<0.05)，MCI-186组较药物对照组降低(P<0.05)，Fyn的蛋白表达各组间差异无显著性(P>0.05)。结论自由基清除剂可能通过抑制癫痫诱导海马组织Fyn的巯基亚硝基化，调节NMDA受体NR2B亚基磷酸化，进而调节NMDA受体通道功能，对神经元起保护作用。

自由基清除剂；癫痫；Fyn；亚硝基化

酪氨酸蛋白激酶Fyn是非受体酪氨酸激酶Src家族(Src、Fyn、Yes、Lck和Lyn等)中的一员，在中枢神经系统中高水平表达。近年来研究发现Fyn与众多生理活动密切相关，参与多种神经元信号通路和谷氨酸兴奋毒性等神经病理过程，在中枢神经系统疾病中发挥重要作用[1]。一氧化氮(nitric oxide，NO)一方面通过NO/cGMP途径，即NO诱导cGMP的产生，调节蛋白激酶G的活性，影响生物体的活动；另一方面，NO还可以共价结合到蛋白质的半胱氨酸侧链上，通过亚硝基化作用即蛋白质巯基亚硝基化修饰对生物大分子的功能进行调节。蛋白质的亚硝基化是一种与蛋白质磷酸化相似的细胞信号转导的重要方式，对蛋白质功能有重要作用的翻译后修饰[2]。我们的离体和在体实验[3,4]显示Fyn存在着巯基亚硝基化修饰。 癫痫是以神经元兴奋和抑制失衡引起的过度兴奋导致神经元群同步异常放电为特征的神经系统疾病，被WHO定义为神经系统疾病中最常见的神经功能障碍。癫痫的发病机制非常复杂，迄今尚未完全阐明，氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、钙超载等多种因素都能诱导神经元异常放电而引发癫痫。在发作过程中，三者之间密切相关，其中氧化应激产生的氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节[5]。因此，抑制氧化应激和清除氧自由基可成为治疗癫痫的重要策略[6]。

本实验用海人酸(kainic acid，KA)制作大鼠癫痫模型，观察大鼠癫痫诱导的海马组织Fyn的巯基亚硝基化水平变化及自由基清除剂MCI-186对其亚硝基化的影响，并探讨其变化的可能机制，为临床癫痫发病机制研究和使用自由基清除剂治疗癫痫提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠，体质量200～300 g，SPF级，中科院上海实验动物中心[动物生产许可证：SCXK(沪)2007-0005，使用许可证：SYXK(苏)2007-0037]。抗Fyn(15) (sc-434)抗体，actin(H-300) (sc-10731)抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。Rabbit polyclonal Anti-SNO-Cys(N5411)，anti-rabbit IgG(T6778)抗体为Sigma-Aldrich，Inc.公司产品。KA为Biomol公司产品。MCI-186为国药集团国瑞药业有限公司生产 。

1.2脑室注射KA诱导癫痫将实验大鼠随机分为4组：癫痫对照组，脑室内注射生理盐水； 癫痫组，脑室内注射KA；药物对照组，腹腔注射生理盐水，脑室内注射KA；MCI-186组，腹腔内注射MCI-186，脑室内注射KA。SD大鼠用乙醚麻醉，定位左侧脑室：前囟后开0.8 mm，旁开1.5 mm，颅骨表面向下3.5 mm。KA溶于灭菌生理盐水中，浓度为60 μg/ml，注射体积为10 L，10 min内注射完成，注射针滞留5 min，以1 mm/min速度取出。癫痫对照组注射相同体积的灭菌生理盐水。大鼠癫痫按Racine分级法分为5级[7]。前驱症状：凝视、点头和湿狗样抖动。1 级：面部肌肉痉挛表现为咀嚼运动；2 级：颈部肌肉痉挛表现为点头运动；3 级：一侧前肢阵挛；4级：站立伴双前肢阵挛；5级：在4级的基础上身体向后倒下。选取4-5级，EEG示痫样放电者供研究使用，每组4只。

1.3给药方式MCI-186以8.0 mg/kg的剂量于KA注射前40 min腹腔注射给药，药物对照组注射相同体积的生理盐水。

1.4样品制备KA注射6 h取海马组织匀浆：KA 注射6 h，大鼠经腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后快速断头取脑，分离海马组织，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马组织加入匀浆缓冲液，用Glas-col匀浆器高速匀浆(10 s×10次)，匀浆液用低温离心机，4 ℃ 1000 g 离心15 min，取上清液，测蛋白后分装，置-80 ℃冰箱待用。

1.5Fyn巯基亚硝基化的测定取蛋白样品200 μg，加入2 μg抗Fyn抗体作免疫沉淀，然后用抗-SNO-Cys抗体做免疫印迹。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应，结果扫描后以Image J分析软件进行分析处理。各条带的O.D以同一张膜上癫痫对照组(saline组)倍数表示。

2　结　果

KA 可以诱导癫痫大鼠海马组织Fyn的亚硝基化，自由基清除剂MCI-186能够抑制Fyn的巯基亚硝基化。Fyn的亚硝基化水平癫痫组和药物对照组增加(P<0.05)，MCI-186组较药物对照组降低(P<0.05)，Fyn 的蛋白表达各组间差异无显著性(P>0.05)。

3　讨　论

Fyn为细胞内非受体型酪氨酸激酶，是Src家族蛋白酪氨酸激酶中的一员，其在中枢神经系统中高水平表达[8]，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中发挥重要作用。我们的实验显示大鼠癫痫可以诱导其海马组织Fyn的巯基亚硝基化，自由基清除剂MCI-186能够抑制癫痫导致的Fyn的亚硝基化水平增高。

蛋白质的巯基亚硝基化(S-nitrosylation，SNO)，是通过一氧化氮共价偶联修饰半胱氨酸侧链的蛋白质翻译后修饰。生物体内的NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸生成。NOS是一氧化氮合成过程中的重要限速酶，它分为神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。体内一氧化氮的作用完全依赖于一氧化氮合酶的活性。在脑中存在的一氧化氮合酶主要是nNOS和iNOS。nNOS主要在神经元表达，具有钙离子/钙调蛋白依赖性，主要介导神经元早期损伤；iNOS不依赖钙离子/钙调素，由炎症介质诱导，引起神经元后期的损伤。动物实验研究发现癫痫后30 min NO水平开始升高，且可维持增高7 d，其峰值在发作后6 h和72 h，此与nNOS活化时间相一致[9]，因此，我们选择癫痫发作后6 h时间点来研究Fyn亚硝基化。

在脑中高度表达的Fyn，参与中枢系统疾病相关的信号通路。通过其自身SH2、SH3结构域与其它分子结合(如Fyn能与PSD95形成复合物)发挥功能。NR2B作为N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体的一个重要调节亚基，是NMDA受体行使其正常功能(如神经元的存活、突触可塑性等)不可或缺的，Fyn可直接磷酸化NR2B而调节NMDA受体功能[10]。

NMDA受体是兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性受体，是大脑中最重要的受体之一[11]，由NRl亚基和NR2亚基(NR2A-NR2D)组成，在癫痫发作的病理生理中起着至关重要的作用。癫痫时NMDA受体被激活后，离子通道开放，Ca2+内流，促使钙-钙调素复合物形成，依赖于Ca2+或钙调蛋白的nNOS活性增强，引起NO合成增多。NO与可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)结构中的Fe2+结合，使sGC发生构象改变而被激活，通过激活的NMDAR/NO/cGMP生化通路，增多的cGMP改变离子通道活性，促使谷氨酸进一步释放，抑制谷氨酸再摄取，正反馈调节NMDA受体活性，同时激活cADP核糖化酶，加剧Ca2+内流，导致恶性循环，引起细胞去极化产生异常放电，导致痫性发作的产生、传播[12]。同时，谷氨酸过度释放，活化NMDA受体，使Ca2+内流，可激活细胞内的蛋白酶及nNOS，产生自由基，损伤细胞膜、结构蛋白及必需酶；并可诱导凋亡促进因子的活化，如p53，死亡促进因子bcl-2家族，caspase家族，核酸内切酶等，促进DNA的裂解，导致神经细胞的凋亡[13]。另外，NO与许多蛋白质(包括Fyn)发生亚硝基化参与细胞凋亡。神经元凋亡即是癫痫发作的结果，又是癫痫发生的原因。在细胞凋亡通路中，NMDA受体介导的兴奋性氨基酸毒性至关重要，起到启动者和执行者的作用。因此，调节NMDA受体功能是癫痫治疗的重要策略。研究表明，自由基既是癫痫发作时脑内异常代谢的产物，同时又参与了癫痫的发生、发展，进一步加重了癫痫时的脑损伤。抗氧化损伤、有效清除自由基逐渐成为人们治疗癫痫、减轻癫痫致神经元损伤的又一探索途径[14]。癫痫导致的氧化应激可诱导Fyn的活化及其下游靶点的磷酸化[15]。MCI-186是一种新型自由基清除剂，具有清除自由基、抗脂质过氧化、保护神经细胞作用，已有研究证实它可以减少内源性NO的产生[16]。我们的实验结果显示海马组织Fyn的亚硝基化水平癫痫组和药物对照组明显增加，MCI-186组较药物对照组显著降低，说明癫痫可以诱导大鼠海马组织Fyn的亚硝基化，自由基清除剂能够抑制Fyn的巯基亚硝基化。推测其可能机制为自由基清除剂减少内源性NO的产生，或逆转了CyS-SNO的效应。这还有待进一步的探讨。蛋白质巯基亚硝基化修饰可通过影响蛋白质活性、蛋白质表达、亚细胞定位、分子间相互作用对蛋白质功能进行调控。癫痫导致的内源性NO，通过巯基亚硝基化修饰可以直接调节蛋白质Fyn功能，也可通过形成二硫键等与NO相关的巯基氧化修饰间接调节其功能。NR2B是NMDA受体的主要调节亚基，我们推测自由基清除剂可能通过抑制癫痫诱导海马组织Fyn的巯基亚硝基化，减少活化，从而调节NMDA受体NR2B亚基磷酸化，进而调节NMDA受体通道功能，阻断其凋亡通路，起到神经保护作用。此可为癫痫发病机制研究和治疗提供新的思路。

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The effect of free radical scavenger on the S-nitrosylation of Fyn in hippocampus of epileptic rats

YUANYuping,HAOLingyun,WEIXuewen.

(DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstPeople’sHospitalofXuzhou,Xuzhou221002,China)

ObjectiveTo investigate whether tyrosine protein kinase Fyn can be S-nitrosylated and the effect of free radical scavenger on the S-nitrosylation of Fyn in kainic acid-induced epileptic rats and to elucidate its possible mechanism.MethodsAdult male SD rats were allotted into 4 groups as following:control group (saline),seizure group (KA),drug control group (KA+saline) and MCI-186 group (MCI-186+KA).Seizures were induced by intra-cerebroventricular injection of KA dissolved in sterile saline.MCI-186 was intraperitoneally administrated to the rats 40 min before KA injection.Measurement of S-nitrosylated Fyn was performed by immunoprecipitation with anti-Fyn antibody,followed by immunoblotting with anti-SNO-Cys antibody.ResultsCompared with saline group,the level of the S-nitrosylated Fyn increased significantly in KA group and KA+saline group (P<0.05).Compared with KA group and KA+saline group,the S-nitrosylation of Fyn decreased significantly in MCI-186+KA group (P<0.05).In contrast,the protein expression showed no obvious alteration (P>0.05).ConclusionFree radical scavenger may involve in inhibiting the S-nitrosylation of Fyn,which suppressed the interactions of Fyn with NR2B and NR2B tyrosine phosphorylation and subsequently downregulated NMDA receptor overactivation,thus protected neurons from epileptic injury.

Free radical scavenger;Seizure;Fyn;S-nitrosylation

1003-2754(2016)04-0327-03

2015-12-28；

2016-03-29

江苏大学医学临床科技发展基金项目(No.JLY20140126)

(1.江苏省徐州市第一人民医院检验科，江苏 徐州 221002；2.徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏 徐州 221002)

魏学文，E-mail：xw-xz@sohu.com

R742.1

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