胃肠胰神经内分泌肿瘤的生物标志物研究进展

黄玲 周东辉 魏涛

●综 述

胃肠胰神经内分泌肿瘤的生物标志物研究进展

黄玲 周东辉 魏涛

神经内分泌肿瘤是一类起源于内胚层神经内分泌细胞的异质性肿瘤，其中胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NET）是最常见的病理类型，近20年来发病率明显升高[1]。神经内分泌肿瘤具有惰性生长、低度恶性、高度恶性等异质性的生物学行为。由于发生率较低、临床症状非特异且复杂、早期影像学检查低敏感及低特异性，目前大多数GEP-NET在发现时临床分期较晚，常伴有局部或远处转移，治疗效果较差[2]。故发现敏感且特异的生物标志物对GEP-NET的早期诊断、疾病进展及疗效评估十分重要。近几年，对GEP-NET生物标志物的研究有较大的进展，但尚无文献对这方面的研究进行归纳，本文将对生物标志物在GEP-NET的诊断、肿瘤生物学行为评估及预后判断等方面的基础及临床研究进展方面进行综述。

1 传统的生物标志物

目前临床应用广泛的血循环生物标志物是嗜铬蛋白A（Chromogranin A，CgA）。CgA是表达在神经内分泌细胞分泌囊泡上的可溶、酸性糖蛋白，几乎所有类型的神经内分泌肿瘤均分泌CgA，血液CgA水平升高被认为与神经内分泌肿瘤的诊断、预后等相关[3]。目前，Tian等[4]对80例晚期GEP-NET患者及65名健康人进行对照研究，结果表明GEP-NET患者血液CgA水平明显高于健康人（93.8ng/ml vs 37.1ng/ml，P＜0.01），且伴有类癌综合征表现或肝转移患者的血液CgA水平明显高于无类癌综合征症状和无肝转移的患者（298.8ng/ml vs 82.9ng/ml，P=0.011；137.0ng/ml vs 64.4ng/ml，P=0.023）。当患者血液CgA≥46.2ng/ml时，患者生存期显著缩短（P=0.045）。另外，Shanahan等[5]研究表明胰腺神经内分泌肿瘤患者术前血液CgA水平与患者术后无病生存期及总生存期呈反比，且术前血液CgA水平是患者术后无病生存期的独立预测因素。

但GEP-NET患者血液CgA检测的特异性较差。CgA在正常组织中也表达，在非GEP-NET患者，如小细胞肺癌、前列腺癌及心脏病、炎症性疾病和肾衰竭的情况下表达可升高[6]。另外，血液CgA基础水平在不同人群、进食不同的食物及服用质子泵抑制剂情况下均可不同[7]。故目前不推荐将CgA作为神经内分泌肿瘤的诊断性筛查指标，该检测更适用于明确神经内分泌肿瘤诊断后患者疾病进展程度、疗效判断及术后复发诊断等[8]。

除CgA外，其他常见的血液生物标志物还有5-尿羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、神经激肽A、胰抑制素等。Ardill等[9]对比研究了500例各类神经内分泌肿瘤患者血液中CgA、5-HIAA、神经激肽A的升高水平，结果表明血液中5-HIAA水平的升高是小肠神经内分泌肿瘤及小细胞肺癌的标志，而在3个生物标志物中，神经激肽A水平升高是小肠神经内分泌肿瘤最特异性的标志物。胰抑制素是CgA的多肽产物，其血液水平不受使用质子泵抑制剂药物的影响，被认为是比CgA更稳定的生物标志物。Sherman等[10]研究表明在小肠及胰腺神经内分泌肿瘤中，血液胰抑制素水平与疾病无进展生存期及总体生存期呈明显负相关。但药物或食物的摄入仍影响血液中胰抑制素的水平。

2 新发现的诊断相关生物标志物

越来越多的证据表明不同类型的神经内分泌肿瘤在基因、生物学等方面存在不同，通过分析基因表达的不同，可以对不同类型的神经内分泌肿瘤作出诊断。

ERO1Lbeta是细胞内内质网处理途径的代表性蛋白，Xie等[11]研究发现相比正常组织，ERO1Lbeta在胰腺神经内分泌肿瘤中表达明显升高，可以作为潜在的病理生物标志物。NKX6-1是在胰腺β细胞的分化、增殖中扮演重要角色的转录因子，使用NKX6-1诊断胰腺及十二指肠分化良好的神经内分泌肿瘤的特异度是93%，在转移性的高分化神经内分泌肿瘤中，NKX6-1仅表达在胰腺起源的神经内分泌肿瘤（敏感度63%，特异度100%），这表明在免疫组化检测中加入NKX6-1有利于区分转移性的神经内分泌肿瘤的原发部位[12]。NETest是对血液中神经内分泌肿瘤的51个基因进行PCR检测并用生物数学联合分析的方法，近年来不少研究显示其具有较强的临床应用潜力。研究表明NETest比使用血液CgA诊断小肠（AUC：0.98 vs 0.75，P＜0.0001）及胰腺神经内分泌肿瘤更加敏感（AUC：0.94 vs 0.52，P＜0.0001）。同时，在诊断侵袭性神经内分泌肿瘤方面，NETest比血液CgA更准确（76%～80%vs 20%～32%，P＜0.05）[13]。另外还有研究结果表明NETest可用于判断GEP-NET手术切除的彻底性，确定是否有残留病灶存在[14]。

3 新发现的预后相关生物标志物

MGMT为细胞中的DNA修复蛋白，负责从DNA鸟嘌呤O6的位置去除烷基加合物。NDRG-1蛋白控制着PTEN及PI3K信号通路之间的负反馈循环,这个平衡在胰腺神经内分泌肿瘤中常常被扰乱。PHLDA-3是胰腺神经内分泌肿瘤中新发现的肿瘤抑制基因表达蛋白。Viudez等[15]以MGMT、NDRG-1、PHLDA-3等3个蛋白表达为基础制定了免疫组化评分对92个术后胰腺神经内分泌肿瘤患者进行研究，结果显示免疫组化评分为胰腺神经内分泌肿瘤患者术后无病生存期和总体生存期的独立预测因素。

Yerci等[16]研究发现生长抑素受体2和生长抑素受体5在GEP-NET上高度表达，生长抑素受体2比生长抑素受体5在GEP-NET上的表达率更高，而生长抑素受体5高表达与患者预后不良相关。sst5TMD4蛋白是生长抑素受体5的缩短片段，Sampedro-Nunez等[17]研究结果显示sst5TMD4蛋白与新生血管的生成密切相关，在胰腺神经内分泌肿瘤中，sst5TMD4蛋白的高表达预示肿瘤具有更强的侵袭性。

核转录因子YY1是胰岛细胞瘤的致病基因，YY1在良性及恶性的胰岛细胞瘤中均呈阳性表达，但恶性胰岛细胞瘤的YY1表达明显高于良性者，这使得YY1可能成为预测胰岛细胞瘤恶性转化的生物标志物[18]。

Alkatout等[19]在对胰岛细胞瘤进行蛋白组学分析时发现乙醛脱氢酶1A1及电压依赖性选择通道蛋白1在恶性胰岛细胞瘤中比良性胰岛细胞瘤表达明显增高，相反，肿瘤蛋白D52则在恶性胰岛细胞瘤中表达减少，且肿瘤蛋白D52低表达是患者无复发生存期及疾病相关生存期的独立预测因素。

CK19是细胞膜角蛋白家族的成员之一，在胚胎发育的早期阶段，胰腺内分泌细胞CK19的表达阳性率极高，但在41孕周后大多数胰岛细胞不再表达CK19，仅管状及腺样细胞仍表达CK19。Son等[21]的研究表明在胰腺神经内分泌肿瘤中，CK19的高表达与肿瘤转移的可能性、肿瘤体积、WHO分期、TNM分期、淋巴血管及周围组织侵袭相关[20]，而Simtniece等的研究结果也证实了这一结论。

正常情况下，INSM1是只在胚胎期表达于神经内分泌组织的转录因子，被认为与协调神经内分泌细胞及神经上皮细胞的分化终止相关。Rosenbaum等[22]使用qRT-PCR技术检测了113个胃肠神经内分泌肿瘤标本，结果显示INSM1在胃肠神经内分泌肿瘤中表达明显升高，且在转移性的神经内分泌肿瘤中表达明显高于无转移者。

HES77是正常情况下表达于人类胚胎干细胞的标志物，Jernman等[23]研究了在72个原发及6个转移的GEP-NET肿瘤标本中的HES77蛋白表达情况，结果表明HES77蛋白的表达可作为直肠神经内分泌肿瘤预后的预测因素，可用于选择有转移高危分险的患者及需要加强术后辅助治疗的患者。

另外，上面提到的NETest技术在评估GEP-NET的预后方面，同样有潜在的临床应用价值。Cwikla等[24]对35例正在进行生长抑素类似物治疗的GEP-NET患者进行临床研究表明，NETest在预测患者生长抑素治疗效果方面的敏感度达100%，特异度为57%，比血浆CgA的检测能更早、更准确地预测患者疾病进展的可能。

虽然目前研究新发现了不少GEP-NET诊断及预后相关生物标志物，但研究的样本量大多偏少，仍需要将来进一步研究来确定其临床可应用性。

4 miRNA

miRNA是一类由19～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，通过转录后水平调节人体至少1/3的蛋白编码基因的表达，其调节功能失调参与到各种肿瘤的形成过程。miRNA基因组的研究表明每种肿瘤形成过程均有特定系列的miRNA功能失调，这使得这些特定的功能失调miRNA可作为不同肿瘤诊断、分期、预后等的生物标志物[25]。

在诊断方面，Johns Hopkins医院的一项研究调查了胰腺癌、慢性胰腺炎、胰腺神经内分泌肿瘤的大批患者及健康对照组中的血循环miRNA的表达情况，结果表明血浆miRNA-1290表达下调有利于区分胰腺神经内分泌肿瘤及胰腺癌（AUC：0.80）。另外，miRNA-584、miRNA-1285、miR-550-002410及miR-1825也被发现在胰腺神经内分泌肿瘤患者的血浆中表达明显下调[26]。

在预后预测方面，Lee等[27]研究则表明miRNA-196a的高表达与胰腺神经内分泌肿瘤患者更快的术后复发、更短的无病生存期及总体生存期相关。Mitsuhashi等[28]研究显示miR-885-5p在直肠神经内分泌肿瘤中高表达是肿瘤侵犯血管淋巴管的独立预测因素。

虽然近年来不断有miRNA作为生物标志物的新研究出现，但miRNA的检测及定量不具备简单、快速、准确、可重复、便宜等适合临床广泛应用的特性及存在不同的检测平台、不同的检测试剂将影响检测结果、数据结果的正规化等问题[29]。故miRNA作为GEP-NET诊断及预后的生物标志物的临床应用还面临着许多挑战。

5 循环肿瘤细胞

尽管有许多不同的技术来计数及隔离循环肿瘤细胞，细胞搜索系统是仅有的被美国食品药品监督局批准的循环肿瘤细胞检测技术。细胞搜索系统使用表皮细胞黏附分子来作为循环肿瘤细胞的检测标志物，并且已经被批准用于乳腺癌、前列腺癌及直肠癌的细胞检测。在转移性GEP-NET中，研究表明50%的患者至少有≥1个循环肿瘤细胞，当肝脏的转移肿瘤负荷＞25%，循环肿瘤细胞数量增加[30]。目前专家共识是循环肿瘤细胞分析还不能作为诊断所有神经内分泌肿瘤的可靠方法，且对于不同病理类型的神经内分泌肿瘤，循环肿瘤细胞检测的敏感度及特异度也不同[8]。循环肿瘤细胞能否成为GEP-NET诊断、预后判断等的生物标志物仍需进一步研究。

6 小结

由于GEP-NET发病率相对较低，发病机制尚未明确，目前发现的大多数生物标志物是单因素诊断指标，且诊断敏感度、特异度相差较大，仍不能进行广泛的临床应用，未来仍需大量进一步的研究及多种生物标志物用生物数学的方法联合分析进行诊断。相信更敏感、更特异的GEP-NET生物标志物将不仅有助疾病早期诊断、评估病情及选择最佳治疗方案，同时也将为靶向治疗提供新的靶点。

[1]Yao J C,Hassan M,Phan A,et al.One hundred years after"carci

noid":epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35,825 cases in the United States[J].J Clin Oncol,2008, 26(18):3063-3072.

[2]蒋学通,王道荣.胃肠道神经内分泌肿瘤诊治的研究进展[J].国际外科学杂志,2014,41(10):700-705.

[3]D'Amico MA,GhinassiB,Izzicupo P,et al.Biologicalfunction and clinical relevance of chromogranin A and derived peptides[J]. Endocr Connect,2014,3(2):R45-R54.

[4]Tian T,Gao J,Li N,et al.Circulating Chromogranin A as A Marker for Monitoring Clinical Response in Advanced Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors[J].PLoS One,2016,11(5):e154679.

[5]Shanahan M A,Salem A,Fisher A,et al.Chromogranin A predicts survivalfor resected pancreatic neuroendocrine tumors[J].J Surg Res,2016,201(1):38-43.

[6]Sciarra A,Monti S,Gentile V,et al.Chromogranin A expression in familial versus sporadic prostate cancer[J].Urology,2005,66(5): 1010-1014.

[7]de Souto B P,Lapeyre-Mestre M,Mathieu C,et al.Prevalence and associations of the use of proton-pump inhibitors in nursing homes:a cross-sectionalstudy[J].J Am Med Dir Assoc,2013,14 (4):265-269.

[8]Oberg K,Modlin I M,De Herder W,et al.Consensus on biomarkers for neuroendocrine tumour disease[J].Lancet Oncol,2015,16 (9):e435-e446.

[9]ArdillJ E,Armstrong L,Smye M,et al.Neuroendocrine tumours of the small bowel:interpretation of raised circulating chromogranin A,urinary 5 hydroxy indole acetic acid and circulating neurokinin A[J].QJM,2016,109(2):111-115.

[10]Sherman S K,Maxwell J E,O'Dorisio M S,et al.Pancreastatin predicts survival in neuroendocrine tumors[J].Ann Surg Oncol, 2014,21(9):2971-2980.

[11]Xie J,Zhu Y,Chen H,et al.The Immunohistochemical Evaluation ofSolid Pseudopapillary Tumors of the Pancreas and Pancreatic Neuroendocrine Tumors Reveals ERO1Lbeta as a New Biomarker[J].Medicine(Baltimore),2016,95(2):e2509.

[12]Tseng I C,Yeh M M,Yang C Y,et al.NKX6-1 Is a Novel Immunohistochemical Marker for Pancreatic and Duodenal Neuroendocrine Tumors[J].Am J Surg Pathol,2015,39(6):850-857.

[13]Modlin I M,Kidd M,Bodei L,et al.The clinical utility of a novel blood-based multi-transcriptome assay for the diagnosis of neuroendocrine tumors of the gastrointestinal tract[J].Am J Gastroenterol,2015,110(8):1223-1232.

[14]Modlin I M,Frilling A,Salem R R,et al.Blood measurement of neuroendocrine gene transcripts defines the effectiveness of operative resection and ablation strategies[J].Surgery,2016, 159(1):336-347.

[15]Viudez A,Carvalho F L,Maleki Z,et al.A new immunohistochemistry prognostic score(IPS)for recurrence and survival in resected pancreatic neuroendocrine tumors(PanNET)[J].Oncotarget,2016,17(18):24950-24961.

[16]Yerci O,Sehitoglu I,Ugras N,et al.Somatostatin receptor 2 and 5 expressions in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumorsin Turkey[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(10):4377-4381.

[17]Sampedro-Nunez M,Luque R M,Ramos-Levi A M,et al.Presence of sst5TMD4,a truncated splice variant of the somatostatin receptor subtype 5,is associated to features of increased aggressiveness in pancreatic neuroendocrine tumors[J].Oncotarget,2016,7(6):6593-6608.

[18]李雯霞,黄业恩,石晓欣,等.YY1在胰岛素瘤中的表达及意义[J].南方医科大学学报,2016,36(3):361-364.

[19]Alkatout I,FriemelJ,Sitek B,et al.Novel prognostic markers revealed by a proteomic approach separating benign from malignant insulinomas[J].Mod Pathol,2015,28(1):69-79.

[20]Son E M,Kim J Y,An S,et al.Clinical and Prognostic Significances of Cytokeratin 19 and KIT Expression in Surgically Resectable Pancreatic Neuroendocrine Tumors[J].J Pathol Transl Med,2015,49(1):30-36.

[21]Simtniece Z,Vanags A,Strumfa I,et al.Morphological and immunohistochemical profile of pancreatic neuroendocrine neoplasms[J].PolJ Pathol,2015,66(2):176-194.

[22]Rosenbaum J N,Guo Z,Baus R M,et al.INSM1:A Novel Immunohistochemical and Molecular Marker for Neuroendocrine and Neuroepithelial Neoplasms[J].Am J Clin Pathol,2015,144 (4):579-591.

[23]Jernman J,Hagstrom J,Maenpaa H,et al.Expression of Stem Cell-associated Marker HES77 in Rectal Neuroendocrine Tumors[J].Anticancer Res,2015,35(7):3767-3772.

[24]Cwikla J B,BodeiL,Kolasinska-Cwikla A,et al.Circulating Transcript Analysis(NETest)in GEP-NETs Treated With Somatostatin Analogs Defines Therapy[J].J Clin Endocrinol Metab,2015,100 (11):E1437-E1445.

[25]Singh R,Ramasubramanian B,Kanji S,et al.Circulating micrornas in cancer:hope or hype?[J].Cancer Lett,2016,381(1): 113-121.

[26]Li A,Yu J,Kim H,et al.MicroRNA array analysis finds elevated serum miR-1290 accurately distinguishes patients with low-stage pancreatic cancer from healthy and disease controls [J].Clin Cancer Res,2013,19(13):3600-3610.

[27]Lee Y S,Kim H,Kim H W,et al.High Expression of MicroRNA-196a Indicates Poor Prognosis in Resected Pancreatic Neuroendocrine Tumor[J].Medicine(Baltimore),2015,94(50): e2224.

[28]Mitsuhashi K,Yamamoto I,Kurihara H,et al.Analysis of the molecular features of rectal carcinoid tumors to identify new biomarkers that predict biological malignancy[J].Oncotarget, 2015,6(26):22114-22125.

[29]Modlin I M,Bodei L,Kidd M.Neuroendocrine tumor biomarkers: From monoanalytes to transcripts and algorithms[J].Best Pract Res Clin EndocrinolMetab,2016,30(1):59-77.

[30]Khan M S,Kirkwood A,TsiganiT,et al.Circulating tumor cells as prognostic markers in neuroendocrine tumors[J].J Clin Oncol, 2013,31(3):365-372.

2016-08-16）

（本文编辑：马雯娜）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院肿瘤外科

周东辉，E-mail：zdh19838@hotmail.com