HPLC法测定红麻青贮饲料中的有机酸

白杰，李德芳，陈安国，李建军，黄思齐，唐慧娟

(中国农业科学院麻类研究所，长沙 410205)

HPLC法测定红麻青贮饲料中的有机酸

白杰，李德芳*，陈安国，李建军，黄思齐，唐慧娟

(中国农业科学院麻类研究所，长沙 410205)

摘要：运用高效液相色谱法对红麻青贮饲料中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸4种有机酸的含量进行同时测定。采用0.02 mol/L NaH2PO4(pH=2.70)与甲醇作为流动相，在Dionex Ultimate 3000液相色谱仪，色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18柱，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长210 nm，进样体积20 μL条件下对青贮样品有机酸含量进行定性分析。结果表明，4种待测有机酸在预定检测范围内线性关系良好(R2≥0.9982)，精密度变异系数<5%，样品回收率在98.73%～102.79%之间。该方法操作简单准确，重复性好，可用于红麻青贮饲料中有机酸的测定。

关键词：红麻；青贮；高效液相色谱法；有机酸

红麻(kenaf)，锦葵科木槿族植物(HibiscuscannzzbinusL．)，一年生韧皮纤维植物，广泛种植于东南亚、欧洲及中国南方部分地区，被认为是多用途作物[1-3]。从上世纪60年代开始，美国学者便率先开展了红麻饲用的研究，国内外研究表明，红麻粗蛋白含量高，产量高，且具有较好的适口性，营养价值很高，适合饲喂家禽和家畜[4-9]。红麻可以作为一种高营养价值的非粮型饲料原料，用以缓解中国南方地区优质蛋白饲料匮乏的矛盾。

青贮饲料中有机酸的含量是评定青贮饲料质量的重要理化指标[10]。青贮过程中产生的有机酸主要分为四种，乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)和丁酸(Butyric acid，BA)。其中，乳酸含量是反映青贮饲料品质的最重要指标，乙酸和乳酸是降低青贮饲料pH值的主要因素，丙酸可以抑制二次发酵，而丁酸的含量则直接反映了青贮饲料的腐败程度[11-12]。文献报道中已有利用高效液相色谱法测定各种青贮饲料中有机酸的方法。由于国内研究起步较晚，有关红麻青贮饲料品质的测定评估方法鲜有报道。本研究旨在利用高效液相色谱法建立一种方便快捷的检测方法，为红麻青贮饲料中有机酸的测定奠定方法基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器、试剂

供试红麻品种为福红992，试验材料采集于湖南省长沙市中国农业科学院麻类研究所创新实验基地。红麻生长期65天进行刈割，粉碎机粉碎至1～1.5 cm，装罐，密封避光处青贮，青贮60天后取出为红麻青贮样。

Dionex Ultimate 3000液相色谱仪，LPG-3400型泵，VWD-3400紫外检测器，Thermo Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，青贮罐(PE材质，体积1000 mL，带内盖，壁厚不低于1.5 mm，直径11 cm)。

乳酸、乙酸、丙酸和丁酸均为分析标准品，购自上海晶纯(阿拉丁)生化科技股份有限公司；甲醇(色谱纯，德国默克)；超纯水。

1.2方法

1.2.1样品浸提液制备提取

充分参考紫花苜蓿和王草[13-14]等作物青贮饲料有机酸浸提液制备方法，准确称取20 g红麻青贮样品于250 mL三角瓶中，加入200 mL蒸馏水，搅拌均匀；置于恒温震荡箱，震荡24 h(4℃，120 r/min)；震荡提取液用4层纱布过滤，再用定量滤纸过滤两次即得红麻青贮浸提液，置于-20℃保存；解冻后用0.45 μm水系滤膜[14]过滤，过滤后的浸提液可直接用于色谱分析。

1.2.2标准溶液配制

用超纯水配制初始浓度为乳酸30 mg/mL，乙酸30 mg/mL，丙酸20 mg/mL和丁酸20 mg/mL的混合标准母液，然后逐级稀释成5个梯度(见表1)。将混合标准液用0.45 μm水系滤膜过滤后，进行HPLC分析，所得数据用于绘制标准曲线(峰面积Y对质量浓度X求回归曲线方程和相关系数)。

表1混合标样溶液中有机酸浓度

Tab.1The concentration of organic acids of mixed standard organic acids

1.2.3色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为甲醇，流动相B为0.02 mol/L NaH2PO4(磷酸调节pH至2.70)。等梯度洗脱，流动相为14% A，86% B，单个样品运行时间25 min，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长210 nm，进样体积20 μL。

2结果分析

2.1有机酸色谱条件确定

2.1.1检测波长的确定

供试青贮样浸提液待检测组分为乳酸、乙酸、丙酸和丁酸，均属于有机一元酸。在205 nm～215 nm范围内对四种酸进行扫描，发现在本试验仪器条件下，波长210 nm时，四种酸出峰情况较其他波长好，因此检测波长选定为210 nm。

2.1.2流动相与洗脱方法的确定

实际的文献报道中，HPLC测定有机酸多可利用缓冲盐溶液以及酸溶液控制流动相的pH。缓冲盐类中，(NH4)3HPO4-H3PO4，KH2PO4-CH3OH 以及NaH2PO4-H3PO4均有报道，其pH均控制在2.65左右。酸溶液类中，H3PO4，H2SO4以及HClO4均有报道，其水溶液pH控制在2.65左右。参考文献报道，本试验将0.02 mol/L NaH2PO4- H3PO4缓冲液和甲醇作为流动相，试验中当NaH2PO4- H3PO4溶液pH为2.70时可以分离出四种有机酸，且效果好于pH值为2.50、2.60和2.80时的分离效果。

洗脱方法确定过程中，分别加入了6%、8%、10%、12%、14%、16%的甲醇，相对应的磷酸盐缓冲液的含量分别为94%、92%、90%、88%、86%、84%，在上述的六种条件下进行测定分析，结果发现在甲醇含量为6%、8%时四种有机酸出峰很小，并且乳酸跟乙酸不能很好分离且丙酸出峰极小，难以达到良好效果；甲醇含量10%、12%时四种有机酸峰型得到改善，乳酸跟乙酸峰型得到较好分离，但是丙酸依旧峰型较小；甲醇含量为16%时，基线漂移较大，开始影响检测准确度。在本试验检测仪器的条件下，甲醇含量为14%的时候能够较好的分离出四种有机酸，因此，本试验采用0.02 mol/L NaH2PO4- H3PO4和甲醇作为流动相进行洗脱。本试验中14%甲醇含量已经较高，如果甲醇含量过高可能会影响检测的准确性，在该条件下，丙酸的峰型有轻微拖尾现象，因此该色谱条件仍需要进一步的优化。

2.1.3流速与柱温的确定

在柱温30℃条件下，对0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min五种流速进行考察，发现流速过低会导致检测时间变长，对组分的分离并无明显影响；而当流速过高时，分离时间会明显缩短，但是柱压增高明显，综合考虑安全和时间因素，采用1.0 mL/min的流速。

温度的升高可使流动相的粘度降低，提高柱效，降低保留时间。在本试验条件下，根据相关文献报道，在25℃、30℃、35℃、40℃四种柱温条件下测试分析表明30℃能很好分离四种有机酸，峰型合适，因此选定柱温为30℃。

根据上述试验筛选条件，混合标样(图1)和样品(图2)中的4种有机酸均得到了较好的分离。

2.2有机酸标准曲线的绘制

对5个梯度的混标溶液进行测定分析，所得数据用于标准曲线的绘制并计算回归方程(表2)，所有回归方程的相关系数在0.9982～0.9997之间，说明在该浓度范围内线性关系良好。

表2有机酸标准曲线回归方程

Tab.2Linear regression equations, relative coefficients and linearity ranges of four organic acids

2.3检测方法的精密度与回收率测定

取混标样品一份，重复测定6次，测算该方法的精密度，结果显示该方法检测结果变异系数均在5%以内(表3)，说明精密度较高，重现性好，满足分析要求；取红麻青贮浸提液适量分成4份，取1份直接测定有机酸含量，其余3份加入不同质量浓度有机酸标准液用以测定回收率，结果显示样品回收率在98.73%～102.79%之间(表4)，符合分析要求(95%～105%)。以上分析结果说明该方法适合检测红麻青贮样品。

表3精密度检测

Tab.3The precision of mixed standard organic acids

表4样品回收率

Tab.4The recoveries for organic acids in kenaf silage

3讨论与结论

一元有机酸因羧基中羰基氧和羟基氧上孤对电子的共轭作用，使其在205 nm～215 nm 处有吸收带，本试验通过筛选确定检测波长为210 nm，与前人研究一致[15-17]。有机酸作为弱酸在水系流动相中容易解离，进而不能被非极性键合相保留，而酸性磷酸氢盐溶液能够抑制有机酸的解离，改善有机酸的保留和分离，本试验选用pH=2.70的0.02 mol/mL的磷酸盐能够将4种不同的有机酸得到较好的分离，这与前人研究一致[18-19]。试验最终通过筛选确定的有机相甲醇比例达到14%，明显高于其他研究报道，理论上有机相比例过高会影响测定的稳定性，但是不同试验以及仪器条件均会使得最后的方案筛选有较大差异，本试验方法能够较好地分离出红麻青贮饲料中的4种有机酸，说明方法可行。由于供试的红麻青贮饲料样品中丁酸含量极低，所以在样品的色谱图中难以标记出，但这同时说明了饲料质量高，没有腐败的发生。

利用试验确定方法对红麻青贮饲料中的有机酸进行分析发现，乳酸含量较高，且丁酸检测值很低甚至检测不到，说明供试红麻青贮饲料质量较好，较易调制成高质量的饲料，这与其他报道一致[7，20]。

本试验结果表明，利用高效液相色谱法测定红麻青贮饲料中的有机酸回收率高，精密度高，变异系数小，分离时间短，分离效果明显。因此，用高效液相色谱法测定红麻青贮饲料中的有机酸是一种简单、快捷、准确的分析方法。

参考文献:

[1]Reta-Sánchez, D.G., Hernández-Dozal, B., Cueto-Wong, J.A., et al. Kenaf forage yield and quality as affected by population density[J]. Crop.Sci, 2010, 50: 744-750.

[2]Falasca, S.L., Ulberich, A.C., Pitta-Alvarez, S. Possibilities for growing kenaf (HibiscuscannabinusL.) in Argentina as biomass feed stock under dry-sub humid and semiarid climate conditions[J]. Biomass.Bioenergy, 2014, 64:70-80.

[3]Alexopoulou, E., Li, D., Papatheohari, Y., et al. How kenaf (HibiscuscannabinusL.) can achieve high yields in Europe and China[J]. Ind. Crops Prod,2015, 68:131-140.

[4]Phillips, W.A., Rao, S.R., VonTungeln, D.L., et al. Digestibility and dry matter intake of diets containing alfalfa and kenaf[J]. J. Anim. Sci,1996, 80:2989-2990.

[5]Webber III, C.L. Crude protein and yield components of six kenaf materials as affected by crop maturity[J]. Ind. Crops Prod,1993, 2:21-31.

[6]梁洪卉，程舟，杨晓伶.马来西亚的红麻研究及开发进展[J].中国麻业,2003,25(6):286-290.

[7]程舟,鲛岛一彦,陈家宽.日本的红麻研究、加工和利用[J].中国麻业, 2001,23(3):16-24.

[8]常宁芳.洋麻蛋白含量分析及叶蛋白生产利用研究[J].草业科学,2006,23(11): 51-52.

[9]白杰，黄思齐，李建军，等.红麻饲用价值的研究进展[J].中国麻业科学，2015,37(1): 30-34.

[10]张英，周汉林，刘国道，等.利用HPLC法测定王草青贮饲料中的有机酸[J].热带作物学报,2013,34(2):377-381.

[11]曹雨丽，刘瑞芳，苏利红.应用高效液相色谱法测定青贮饲料中有机酸含量的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2013(21)：86-87.

[12]刘桂要.玉米秸秆青贮过程中微生物、营养成分及有机酸变化规律的研究[D].西安:西北农林科技大学，2009.

[13]刘秦华，张建国，卢小良.乳酸菌添加剂对王草青贮发酵品质及有氧稳定性的影响[J].草业学报,2009,18(4):131-137.

[14]许庆方，玉柱，韩建国，等.高效液相色谱法测定紫花苜蓿青贮中的有机酸[J].草原与草坪,2007(2):63-67.

[15]赵景婵，郭治安，常建华， 等.有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究[J].色谱，2001,19(3):260-263.

[16]贾洪锋，贺稚非，李洪军，等.高效液相色谱法测定发酵辣椒中的有机酸[J].食品科学,2008,29(3)：374-379.

[17]韩晓鹏，牟德华，赵英莲，等. HPLC法检测树莓果汁和果酒中的有机酸[J].酿酒科技,2015(5):107-110.

[18]雷萍，黄志英.高效液相色谱法检测分析饲料有机酸化剂中甲酸和丙酸的含量[J].饲料工业,2010,31(6):54-55.

[19]柳俊超，姜俊芳，宋雪梅，等.青贮饲料中主要有机酸的高效液相色谱分离分析[J].畜牧与兽医,2015,47(10):47-52.

[20]房晓彤，董淑霞.红麻叶青贮的饲用价值[J].中国乳业,2001(12)：22-23.

Determination of Organic Acids in Kenaf Silage by HPLC

BAI Jie，LI Defang*，CHEN Anguo，LI Jianjun，HUANG Siqi，TANG Huijuan

(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China)

Abstract:To establish a method of determining four kinds of organic acids(Lactic acid, Acetic acid, Propionic acid and Butyric acid) in kenaf silage by using high performance liquid chromatography (HPLC). Dionex Ultimate 3000 was used to separate organic acids, equipped with a chromatographic column Thermo Hypersil BDS C18. 0.02 mol/mL NaH2PO4(pH=2.70) and methanol was used as mobile phase with a flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature and UV detection wavelength were set at 30℃ and 210 nm, respectively. The results showed that four organic acids can be separated successfully, all the calibration curves for these organic acids displayed a good linear relationship with correlation coefficients above 0.9982(R2≥0.9982), and the coefficient of variation of four kinds of organic acids was less than 5% (n=6). The recovery rates of four organic acids were in the range of 98.73%～102.79%.This method is convenient, rapid, accurate and applicable to determine organic acids in kenaf silage.

Keywords:kenaf; silage; high performance liquid chromatography (HPLC); organic acids

文章编号：1671-3532(2016)03-0105-06

收稿日期：2015-11-11

基金项目：现代农业产业技术体系(CARS-19-E07)；中国农业科学院创新工程(ASTIP-IBFC03)；国家青年自然科学基金(31300240)；长沙市科技计划(K1303002-21)

作者简介：白杰(1989-)，男，硕士研究生，研究方向为红麻饲用品种选育。E-mail：baijie5266@163.com。 *通讯作者:李德芳(1962-)，男，博士/博士生导师，二级研究员，主要从事一年生麻类作物育种。E-mail:chinakenaf@126.com。

中图分类号：S563.5

文献标识码：A