脲原体检测的方法学研究进展

2016-01-25全可新综述周运恒审校武警上海市总队医院检验科上海201103

中国男科学杂志 2016年3期

全可新综述周运恒审校武警上海市总队医院检验科（上海 201103）

脲原体检测的方法学研究进展

全可新综述周运恒审校
武警上海市总队医院检验科（上海 201103）

脲原体（Ureaplasma spp.）是目前发现能在无生命培养基上生长繁殖的最小微生物，对培养基的营养要求较高，一般是以牛心浸液作基础，添加10%～20%动物血清及10%新鲜酵母浸液等，生长需要一定的pH值和温湿度等［1］。在2002年之前，一直认为脲原体只有一个种，解脲脲原体，或溶脲脲原体/解脲支原体，之后根据表型和基因型特征分为两大生物群共14个血清型［2］。目前，国内仍有很多文献默认解脲脲原体为脲原体的唯一个种。脲原体属于条件致病病原体，可黏附在泌尿生殖道的粘膜及上皮细胞，是引起性传播疾病的常见病原体，还可以引起宫颈炎、盆腔炎、不孕不育、不良妊娠、前列腺炎、附睾炎等，致病性最强的是孕妇和新生儿［3-7］。流行病学调查提示，成年女性泌尿生殖道脲原体检出率为40%～80%，男性为20%～58%［8］。其检出率差别较大，可能与受检人群和检测方法等因素有关。目前，临床上检测脲原体的主要方法有液体培养法、固体培养法、免疫学方法和分子生物学方法等，各种方法均有一定的优缺点，现综述如下。

一、液体培养法

目前国内临床实验室采用的主要检测方法是液体培养法。该法操作简单、仅靠肉眼结果无需特殊的仪器设备，商业化的支原体培养、鉴定、计数及药敏一体化试剂盒可以对脲原体进行半定量的检测和对四环素类、大环内酯类和喹诺酮类抗生素进行定性药敏检测。其主要原理是脲原体可以分解尿素产NH3，根据培养基内的酚红指示剂颜色变化来判断是否有脲原体生长。严格地说这种做法是错误的，只能算是脲原体分离培养的第一步。但液体培养法可以半定量计数，凡≥104颜色变化计数单位（color change units，CCU）/mL鉴定孔试剂变色为支原体阳性，≤104CCU/mL为携带者或无致病意义。

目前国内生产脲原体试剂盒的厂家众多，质量也参差不齐，检测的灵敏度和特异性各有差异，而且缺乏质控品和统一的标准，因此无法对商品化的试剂进行统一评价［9］。该法已经在临床上沿用20年之久，存在杂菌干扰而致的假阳性、假阴性和容易污染使结果难以判断等缺点。尤其是女性由于生理结构的原因，栖居较多分解尿素的阴道菌群和宫颈菌群，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯、铜绿单胞菌和变形杆菌等。另外标本中某些酵母菌和葡萄球菌的污染以及少量碱性标本也是液体培养法假阳性增加的原因［10］。据曹爱国等研究报道液体培养基的假阳性率在20%左右［11］，也有报道用再培养法可以降低假阳性率［12］。

二、固体培养法

固体培养法可以通过显微镜观察支原体特有的如“海胆型”或“油煎蛋样”菌落，可以同时鉴别多种支原体，灵敏度和准确性较高，不容易污染，是微生物诊断的金标准［13， 14］。但由于操作麻烦、培养时间长、成本较高以及有效期短等原因，再加上液体和固体法之间的阳性率也有一定的争议，而且支原体形态和菌落较难辨认以及存在异质性等问题，目前国内外临床上固体培养法应用甚少。

传统的支原体分离培养过程应有两部分，肉汤增菌和滤液转种，观察其菌落形态，然后进行Diense染色和生化反应最终报告［15］。美国2010年第10版的《Manual of Clinical Microbiology》和中国2007年第三版的《全国临床检验操作规程》都要求支原体的分离培养都包括肉汤增菌和转种固体平板［16，17］。但这种间接转种法需要将培养阳性的标本转种到固体琼脂上，耗时更长，操作更加繁琐，阳性率偏低，而且转种的时间选择不当也会对结果造成影响，比如支原体含量高的标本增殖高峰在6～12 h，而支原体含量低的标本，增殖的高峰在12～24 h，增菌时间过长转种会导致假阴性培养结果，如果转种时间过短，小于10 h，可能没有在支原体的对数生长期，也会导致阳性率降低［18］。

目前市场上主要用的是支原体选择性固体琼脂培养法，各种泌尿生殖道标本均可以直接接种，48～72 h观察结果，镜下观察背景很清晰，利用划痕能很快找到琼脂层表面并在划痕附近找到支原体菌落，有利于菌种分离、纯化、保存以做进一步研究，还可通过菌落形成单位（colony forming units，CFU）推断出标本中支原体的真实含量，显示出比液体培养基更为准确、定量的优点。固体-液体培养法联合检测具有更高的敏感性和特异性，最近吴磊等［19］报道固体培养与液体培养同时接种样本，明显缩短了固体培养的检测周期，超过85%的支原体在24 h以内观察到菌落，而48 h以内固体培养与液体培养的阳性率几乎没有差别。

三、免疫学方法

免疫学方法可通过直接检测特异性抗原或抗体来判断是否感染脲原体，可对脲原体的感染做出早期、快速的诊断。其操作简单，快速，无需特殊设备，结果容易判断，在临床上可作为脲原体感染的辅助诊断指标。常用的是金标法，可一次检测大量标本，对脲原体感染的快速诊断及流行病学的研究调查具有较大的实用价值［20］。人体感染脲原体后，能产生特异性IgM类和IgG类抗体。IgM类抗体在感染1周后出现，3～4周达高峰，当患者出现临床症状而就诊时，IgM抗体水平一般比较高，因此可作为急性期感染的诊断指标。IgG抗体比IgM出现晚，需连续监测观察，在恢复期血清抗体效价比急性期血清效价增高4倍以上，才有诊断意义［21］。另一方面，由于健康人群中脲原体检出率也很高，所以用抗体滴度很难解释脲原体的感染，血清中抗体含量比较低也会出现假阴性，另外结果容易受到溶血、脂血的影响，导致免疫学检测法的特异性不高，也未标准化，所以目前临床上未能广泛应用。在脲原体的分型方法学上，基于抗脲原体血清型单克隆抗体的血清学分型研究发展最早，最初采用生长抑制试验或代谢抑制试验判断菌株血清型别，但由于抗血清制备烦琐，难得到商品化的各种抗血清，且不同抗血清型的单克隆抗体之间有不同程度的交叉反应，缺乏可重复操作性，在临床上也无法应用［22］。

四、分子生物学检测

分子生物学检测主要是根据脲原体的尿素酶基因、多带抗原基因和16S rRNA-23S rRNA基因进行扩增检测，应用较多的是聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction， PCR），以及在此基础上的其他PCR技术。例如，陆春等于2004年用聚合酶链反应-单链构象的多态性技术（PCR-SSCP）鉴定脲原体生物群和基因型［23］。Vancutsem于2011年用荧光实时定量PCR进行分群［24］。Xiao于2010年建立了多重实时荧光定量PCR技术，可以对脲原体的两群14个型同时进行鉴定［25］。近期谢鑫友教授采用多位点序列分型（multilocus sequence typing， MLST）对脲原体进行分群和分型，建立脲原体的MLST数据库，揭示脲原体致病性和主要毒力株的MLST型，发现主要致病性克隆，为预防阻断流行株的传播和个体化治疗提供依据［26，27］。

分子生物学方法简便、快捷、灵敏度高、特异性高、重复性好、可以定量测定，目前在临床上广泛应用，但需要严格、规范的实验环境和特殊的仪器设备，并且不能进行药敏试验，在基层单位难以开展。另外，PCR方法灵敏度极高，在整个操作过程中PCR产物的污染会产生假阳性；PCR对死细胞同样能进行扩增，能够检测出无复制活性的基因片段而导致假阳性。目前主要用于致病性和分群等方面的研究，研究表明并非所有的脲原体生物型都致病，其致病性可能与生物群或血清型别、宿主免疫力、性伴数、感染浓度、感染时间和机体微环境等多种因素有关［28，29］。

结　论

随着脲原体致病性的深入研究，其检测方法也在不断的更新和规范，目前临床上使用的各种方法各有优势和不足。液体培养法由于操作简便、价格低廉、不需特殊设备、可以观察药敏结果等原因在国内尤其是基层医院仍会长期使用。为了提高特异性和准确性，最好用液体培养法和固体培养法一步法联合使用，既可对混合支原体进行定性和定量检测，又可进行定性药敏试验。分子生物学检测方法可以快速准确地对脲原体进行分群和分型鉴定，为进一步研究其分子流行病学、致病机制和耐药机制提供依据。分子生物学和培养法互相补充，可以快速分离、培养和鉴定脲原体，能够准确衡量是否需要治疗或是否治愈的荧光定量PCR定量技术将是未来检测脲原体的研究方向。

致谢：本文由上海市自然科学基金（13ZR1449700）基金项目资助

关键词脲原体属；分子生物学

参考文献

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