国内外柳树植原体病害研究现状

赖刚刚，李 丰，党金欢，冶子耕，张 萍，朱天生

（塔里木大学植物科学学院/南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

0 前言

柳树（Willow），杨柳科柳属，双子叶落叶乔木，对环境的适应性广，喜光，喜湿，耐寒。其品种繁多，全球约520余种，中国有250余种且分布在全国各地。作为一种重要的观赏性树种，柳树在我国的栽培历史已有2000多年。柳树生命力强，栽培方法简单且易繁殖，是重要的绿化用树，许多国家将其作为城市、小区、园林和道路等绿化树种，在观赏、工艺与环境方面都有极大价值，在部分干旱地区维持生态平衡有很大优势，对于区域经济的发展也具有重要作用。

植原体（Phytoplasma）过去称作类菌原体（Myco⁃plasma-like Organism，MLO）是一类专性寄生菌，属原核生物界（Prokaryota）柔膜菌纲（Mollicutes）[1]。无细胞壁，由叶蝉和飞虱等刺吸式口器昆虫传播，也可通过菟丝子和嫁接进行传播。寄生于植物韧皮部和昆虫的唾腺细胞。植原体病害最早记载是在1000 多年前，在我国宋朝的牡丹花上发现，由于牡丹花发病后形状奇特而被人们认为是花之典范[2]。我国明崇祯末（约公元1640 年前后）《沈氏农书·运田之法》中也有记载桑树矮缩病[3]。科学界最早记载是在200 年前日本的桑树上发现桑树矮缩病，1967年日本植物病理学家土居养二（Doi）利用电子显微镜在表现丛枝症状的桑树等植物韧皮部筛管细胞中发现类似“支原体”的微生物，后命名为类菌原体[4]，引起植物病理学界广泛关注，极大推动植原体的研究。1992 年第9 届国际支原体大会上，比较支原体国际研究项目植原体工作组（IRPCM）首次提议用“植原体”（Phytoplasma）这个名字来代替“类菌原体”（Mycoplasma-like organisms）[5，6]。1994年第 10届国际菌原体组织会议上类菌原体正式被更名为植原体[3]。

1 国内外植原体研究现状及分析

1.1 植原体生物学特性

植原体具有复杂的细胞结构，由厚度约为10nm的2层蛋白质膜和中间一层脂肪膜组成的单位膜包裹[7]。其直径200～800nm，形态各异，有球形、椭圆形、棒形、细丝状[8，9]、不规则形等，其形态随所处环境的不同而发生变化[4]。植原体主要分布在被害植物韧皮部的筛管、伴胞、韧皮薄壁细胞及韧皮纤维中；在介体昆虫中主要分布于唾液腺和脂肪体组织中[10]，可侵染昆虫的卵，还可在昆虫体内进行繁殖。目前为止，植原体尚不能像其他细菌一样人工体外培养。Nicoletta Contaldo[11]等人在2012 年报道了对植原体的纯培养方法，但由于该方法操作繁琐、成本代价高未被广泛应用到植原体研究中。

植物被植原体侵染后，会在不同的部位引起一系列相应的症状变化，如芽、茎、叶、花等不同部位会产生不同的症状，使植物的代谢发生紊乱。感病植物所表现出来的症状也会随植物所处生长时期不同而发生变化，某些抗病植物表现出来的症状也会不明显。国际上已见报道的植物被植原体危害后表现出来的症状主要有丛枝、黄化、花变叶、矮化、簇生、小叶、扁茎等。

1.2 植原体分类

由于植原体种类繁多，侵染不同的寄主植物后寄主表现出相同或相似症状，几种植原体复合作用后引起的植物病害很难鉴定，加之植原体引起的症状与病毒引起的极为相似，因此植原体的研究面临着许多困难与挑战。早期研究人员主要根据寄主植物被植原体危害后，所表现出的症状及介体昆虫的专化性这两类特征对植原体进行分类，但这种分类方法并不全面和系统。目前植原体的分类主要还是依据其16S rRNA、rp（核糖体蛋白）、secY（分泌蛋白）等保守基因序列和基因组差异，及对传播介体、天然植物寄主和限制性酶切片段多态性分析。根据植原体16S rRNA基因序列RFLP分析图谱的相似系数，可将部分植原体分为不同的组及亚组[12]。2007年Wei wei等[13]用计算机模拟和RFLP分析鉴定了10 个新的植原体组。截止2019 年6 月植原体已鉴定划分为52个暂定种、36个组和100多个亚组[3]；被完整测序的植原体基因组已有6 种，植原体基因组草图测序成功的也有19种[7]。植原体基因组中有两个rRNA操纵子，而这两个rRNA操纵子基因序列存在同源异质性，因此，在植原体16S rRNA 基因克隆测序中会出现序列不一致的结果，所以在分类鉴定中尽量选择高度保真的DNA 聚合酶进行PCR 扩增，并多挑一些单克隆抗体进行测序，以保证植原体的16S rRNA 基因序列的真实性。虽然16S rRNA基因序列较为保守，可以较好地对植原体进行种、组和亚组的区分，但难以对种内不同株系进行区分。对植原体种内进一步分类，应更多地克隆测序种间保守、种内变异较大的基因，如tuf（与蛋白质合成有关的延伸因子EF-Tu）基因、rp基因、secY基因、膜蛋白基因等，并对以上基因进行序列一致性比对和分析[3]。tuf基因除了用于确认植原体菌株的分类地位之外，还可以追踪寄主植物和昆虫载体中的植原体菌株的扩散[14]。植原体的分类鉴定，还应注重植原体的寄主范围、特定植物寄主症状及不同的传播昆虫介体等植原体生物学特性的研究。

1.3 植原体检测

在过去的几十年里，由于没有获得植原体的纯化培养基，所以对植原体的检测，通常是通过寄主植物所表现出来的症状选择将感病植物制成超薄切片，进行观察判断；因植原体对四环素及其衍生物类的药物敏感，给感病植物注射四环素，若症状消失，则证明感染植原体[4]；或根据寄主植物的种类、表现出来的症状、传播介体等也可对是否植原体进行判断。但由于寄主植物间差异、种类差异、抗性差异、环境因素等，对植原体进行鉴定时，耗时耗力且鉴定结果不一。随着科技的发展及电子计算机水平的进步，目前，应用于植原体的检测方法主要有电子显微镜法、组织化学法、血清学方法、PCR法和核酸杂交法等。

1.3.1 电子显微镜法

植原体无细胞壁，且形态大小容易受环境的影响，在电镜下观察到的形态有球形、杆状、细丝状、不规则形等，大小在200～800nm 不等。该方法可直接观察到植物组织结构中的植原体，具有较高的可行性，缺点是需要复杂的仪器设备，耗时耗力，费用高，难以普及。

1.3.2 血清学方法

1985年，Lin等[15]首次报道成功制备翠菊黄化病植原体的单克隆抗体。1988年，Chen等[16]也成功制备玉米丛矮病植原体的单克隆抗体。林木兰等[17]成功制备泡桐丛枝病植原体的单克隆抗体，并进行泡桐丛枝病的检测。随后，科研工作者又相继成功制备了多种植原体的单克隆抗体并开展病害诊断。目前，主要的血清学方法有：琼脂双扩散、酶联免疫吸附测定、点免疫测定、荧光免疫及免疫电镜技术等。

1.3.3 核酸杂交技术

核酸杂交技术是利用超速离心技术等获得待研究植原体的DNA，然后将其酶切，回收片段DNA，将该片段标记制成DNA探针，通过杂交该探针来检测植原体。特别是在检测木本植物中的植原体时，该方法具有快速灵敏的特点，但由于某些木本植物中植原体浓度低，也使该技术的使用受到一定限制。目前，主要的核酸检测技术有：点印迹杂交技术、原位杂交技术和Southern 杂交技术。

1.3.4 组织化学法

组织化学法是利用荧光染料与光学显微镜对植原体进行检测。主要有DAPI 荧光显微技术、迪纳氏染色、苯胺蓝染色等方法。DAPI对真原核细胞的核具有极高的灵敏性，是检测植原体的高效荧光染料。组织化学法是一种间接的检测手段，在被害植物植原体含量较低、植物组织中胼胝质含量积累、含有大量酚类物质及DNA 干扰物时，可能会出现假阳性结果，应用时会受到限制，可作为辅助手段。

1.3.5 PCR技术

目前用于植原体检测的有巢式PCR（Nested PCR）、免疫捕获PCR（Immuno capture PCR）、竞争PCR（COP-PCR）、循环PCR（Rcycled-PCR）和实时荧光PCR 技术（Real-time PCR）等。巢式PCR 是使用两对通用引物对植原体进行两轮扩增，从而提高检测的灵敏度；免疫捕获PCR是采用单克隆抗体或多克隆抗体选择性捕捉植原体DNA，再以捕捉的植原体DNA 为模板，用通用或特异引物进行PCR 扩增，从而避免复杂的模板DNA 抽提过程，同时还提高植原体的检测灵敏度[14]。

实时荧光定量PCR 技术是指在常规PCR 反应体系中加入荧光标记探针，该探针与PCR产物杂交时，能检测到荧光信号，因而荧光信号反映了PCR扩增产物的数量[18]。该技术比常规PCR具有更高的灵敏度、且能快捷简便地定量检测植物病原，还具有核酸杂交和光谱技术的高精确性和高特异性，在植原体检测工作中具有广阔的应用前景。我国廖晓兰等[19]首次将实时荧光PCR 法用于植原体病害的检测，设计并合成椰子致死黄化、苹果丛生、榆树黄化3组植原体特异性荧光探针和植原体广谱荧光探针，成功对植原体进行分类鉴定[20]。

1.3.6 LAMP（环介导等温扩增技术）检测

近年来，LAMP 检测已被用于检测寄主组织中的植原体，是一种全新的核酸扩增方法，该方法具有检测成本低、速度快、操作简易、特异性强、灵敏度高和可视化等优点，非常适合在基层推广和病害现场的快速检测。2015年韩剑等[21]运用LAMP技术建立枣疯病植原体可视化检测技术；2017年王圣洁等[18，22]建立寡核苷酸管芯片技术检测和鉴别植原体技术体系，并利用LAMP 技术，以tuf基因为靶标扩增5 种16SrⅠ组植原体。此外，还建立了一些替代诊断方法，例如异源双链体移动性测定[23]、单链构象多态性[24]、T-RFLP[25]等。

1.4 植原体病害综合治理

植原体病害以预防为主。加强检疫与预防，利用寄主植物抗性、有效控制传播介体、切断传播途径并结合化学防治等方法来综合治理。

1.4.1 农业防治

植原体病害的农业防治方法主要是消除侵染源，从源头阻断植原体的传播，如加强植物检疫，保证苗木及嫁接穗无病害；加强病虫害防治，阻断叶蝉、飞虱等刺吸式昆虫的传播，控制中间寄主。阳小勇等[26]提出测土配方防治方法，即测定土壤中各种养分的含量，缺哪种元素就进行相对应的补充，保持作物健壮，从而提高作物抗病力。

1.4.2 物理防治

主要是通过热、冷处理的方法来脱除植物体内的植原体。高温对植原体的生长发育有直接的影响。低温也能有效脱除植物体内的植原体病原。

1.4.3 化学防治

植原体对四环素及其衍生物类药剂较为敏感。2015年冯文全等[27]以呼和浩特市柳树丛枝病为研究对象，用利福平、利福平+苯氧威和苯氧威等不同药剂做药效试验，结果表明3%的苯氧威对柳树丛枝的抑制效果较为明显。李岩峰等[28]报道四环素和阿维菌素两种药剂复配后通过喷洒和树木输液的方法，能够有效防治植原体病害，还有助于杀死传播介体昆虫。也有人提出植物激素治疗，但需要进一步研究和实验数据支持[29]。

1.4.4 生物防治

在植物叶面喷施生物农药，如枯草芽孢杆菌，阿泰灵等可增加植物的抗性，有效缓解植原体对作物的危害。

1.4.5 选育抗病良种

刘晓光等[30]以枣疯病植株培养苗中出现的疑似抗病株为材料，观察并提取DNA进行测定。在筛选的10株疑似抗病变异株中，经过植原体检测后发现其中3 株内仍携带有少量植原体，进一步对这些疑似变异株进行DNA 水平的AFLP 分析，最终筛选出1株抗病株。

2 柳树植原体病害研究现状

2.1 为害症状

国内外已见报道的柳树植原体病害主要有柳树丛枝（Willow witches-broom）、柳树黄化（Willow yellows）、柳树增生（Willow proliferation）和柳树花变叶（Willow phyllody）等（图1），并被划分到16SrⅠ组、16SrⅥ组、16SrⅨ组和16SrⅫ几个不同亚组。柳树感染植原体后，由于植原体寄生于寄主韧皮部组织中，会随着植物水分和养分运输到树体顶端，因此柳树植原体病害的症状多发生于树体新抽枝条或顶端；除表现出以上典型症状之外，还出现小叶、球状结构、非季节性落叶、枝条干枯等症状，随着植原体含量不断积累，树体水分和养分供应不足，最终造成树木顶枯甚至死亡；另外，在部分干旱地区6—7月份温度高、蒸发快，当树体感染植原体后，养分和水分会供应不足，使柳树提前进入落叶期，树叶发黄、脱落，造成非季节性落叶现象。

2.2 国内研究现状

我国最早报道该病害是在1992 年王纯利[31]等发现新疆白柳丛枝病，当时部分研究者认为是由螨类危害引起的，但通过电子显微镜在柳树韧皮部观察到哑铃状无细胞壁颗粒，证明该丛枝病是由类菌原体引起；上世纪90年代植原体病害全疆各地均有发生，但由于当时技术条件不足，未能从分子水平将其鉴定与分类。2005年朱天生等[32，33]调查南疆柳树花变叶植原体病害，巴州地区发病率约10%，克州地区发病率为6%，喀什地区、图木舒克市、阿克苏地区、阿拉尔市和和田地区发病率分别为46%、51.3%、64.3%、51%和48%，2007年对来自新疆阿拉尔市的柳树花变叶进行鉴定，通过16SrRNA和rp基因分析将其划分到AY 植原体组的16SrI-B 亚组。2009 年魏婷等[34]在陕西发现柳树黄化植原体，并将其划分于16SrΙ-C亚组。2011年Ana Alfaro-Fernan⁃dez[35]等报道西班牙东部地区发生柳树植原体病害，发病柳树表现出小叶、黄化和球状的症状，将其划分到16SrⅫ组。2012年张磊[36]等发现内蒙古鄂尔多斯市柳树表现出丛枝、黄化、小叶、增殖和球状等异常现象，对16SrDNA 进行RFLP 分析将其划分到16SrⅥ-A亚组，这是我国首次将植原体分类到16SrⅥ-A 亚组。Mou[37]等在2014 年报道湖南省元谋县发现柳树植原体病害，柳树表现出丛枝和花变叶等异常症状，通过对 16SrRNA 基因、tuf基因和rp基因进行分析，将其划分至16SrΙ-B亚组。

2.3 国外研究现状

国际上最早是1972 年Holmes[38]等在美国新罕布什尔州发现柳树丛枝病，后来欧洲柳树上也发现相似病害，研究者通过电子显微镜观察到无细胞壁的形态多样颗粒，证明该病害与美国发现的为同一类病害，由于当时科学技术水平有限，无法证明其为植原体病害。1978年Varma[39]在印度也报道了柳树丛枝病害。1994 年 Abdul-Hameed Khadha 等[40]在加拿大首次发现柳树丛枝植原体病害，通过扩增和分析16SrDNA基因发现其为三叶草增殖组成员，当时柳树丛枝病在加拿大几种柳树上普遍发生，另外还有部分植原体属于翠菊黄花组（16SrΙ 组）。2017年Maryam Ghayeb Zamharir[41]等在伊朗发现柳树丛枝表现出的症状与我国新疆和内蒙报道的柳树植原体引起的症状极其相似，经系统发育分析后认为该植原体属于16SrⅫ组，与西班牙柳树丛枝植原体为同一组。2018 年 Fatemeh Shahryari 等[42]又报道伊朗柳树增殖，经过系统发育分析和RFLP分析，该植原体为16SrVI-A亚组成员。

3 结论与讨论

自PCR技术出现以来，该技术对于植原体的检测一直稳定有效，LAMP 检测提高时效性。由于植原体不能体外培养，DNA 获取含量少，操作时容易污染；PCR 检测过程也容易出现假阳性结果，不能准确检测植原体，需要通过测序获得基因片段序列后才能确定，此过程代价较大，因此亟需开发有效快速的特异性检测技术。

植原体病害在世界的分布范围越来越广，寄主范围不断扩大，家族成员也越来越丰富。近年来，印度和伊朗报道柳树植原体病害较多。柳树不像梨、杏和枣等一些经济树种能带来直接经济效益，因此，柳树植原体病害尚未纳入检疫性病害，对该病害的传播、流行和防治等方面研究并不多。而柳树植原体病害存在潜在的巨大危害，不仅严重危害柳树，造成柳树几年内干枯甚至死亡，导致严重的损失；另外植原体引起柳树形成的丛枝、花变叶、增殖和球状等症状，还会为部分农业害虫提供良好的越冬场所，间接对农业生产形成严重威胁。目前，亟需提出科学有效的防治措施来控制柳树植原体病害传播与发生，以减少农林业生产损失。