多能干细胞视网膜定向分化研究进展

颜廷宇，孔珺

（中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005）

·综述·

多能干细胞视网膜定向分化研究进展

颜廷宇，孔珺

（中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005）

在发达国家，年龄相关性黄斑变性等视网膜变性类病变是导致不可逆性视力丧失的主要原因，以视网膜色素上皮（RPE）细胞的功能障碍及损伤为病理生理学基础。目前，临床上尚无有效的逆转视网膜变性类病变视力丧失的手段，临床试验中的RPE细胞移植及基因治疗有望成为未来有效的治疗措施。胚胎干细胞（ESC）及诱导性多能干细胞（iPSC）的眼部定向分化为眼部单细胞病变类疾病的细胞移植治疗提供了可能性。本文总结了ESC及iPSC眼部视网膜细胞定向分化的研究进展，并对其未来发展前景进行初步探讨。

胚胎干细胞；诱导性多能干细胞；眼；分化；视网膜变性

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胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC），是来源于囊胚内细胞团的一种多能干细胞。人类胚胎受精后4～5 d的胚泡期内细胞团由50～150个细胞组成，处于种植前的囊胚阶段。ESC具有正常核型，能够保持端粒酶高活性，并表现出显著的长期增殖潜能，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性［1］。ESC既可以一直保持未分化的状态，也可以定向分化成内胚层、中胚层和外胚层来源的细胞。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）是通过将特定基因、特定基因产物或小分子化合物导入体细胞中，使体细胞重新编程而获得的具有ESC特性和功能的细胞［2］。近年来，ESC与iPSC向眼部定向分化和移植的相关基础和临床研究成为热点并发展迅速。现主要就ESC向眼部视网膜细胞定向分化的研究进展予以综述。

1　诱导ESC眼部定向分化

视网膜变性疾病，如年龄相关性黄斑变性（age⁃related macular degeneration，AMD），是导致不可逆性视力丧失的主要原因。在此类疾病中，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的功能障碍导致了疾病的发生。随着RPE的退化，光感受器开始凋亡，患者的视力开始丧失。就目前而言，细胞移植对于视网膜变性疾病有一定的治疗效果，而ESC是其重要的供体细胞来源之一［3］。如何高效控制ESC定向分化是研究的热点。

1.1诱导生成视网膜光感受器细胞

MELLOUGH等［4］模仿神经和视网膜发育过程，通过将无血清无滋养细胞培养条件与已知生长因子以及代谢产物相结合，成功地将ESC和iPSC分化为光感受器细胞。该研究在为期60 d的hESC与hiPSC分化培养中，通过对标志物OPNISW和RHO⁃DOPSIN的检测，证实其分化有效率要高于以往报道。其中，只有B27和（或）N2作为补给的培养基要比多成分培养基的分化效率更高，说明在分化过程中B27与N2发挥了重要作用。同时，在分化早期，DKK1和Noggin在促进hESC与hiPSC分化成视网膜祖细胞以及光感受器前体中扮演着重要角色。

1.2诱导生成RPE细胞

对视网膜变性疾病患者进行细胞移植，最首要的问题是需解决如何获得大量且安全可靠的供体细胞的问题。通过具有无限增殖潜能及多能性特性的ESC及iPSC定向分化成RPE细胞，有望解决供体细胞来源问题。

在ESC分化成RPE的过程中，尼克酰胺（nico⁃tinamide，vitamin B3，NIC）具有重要的正向作用。NIC存在时，Activin A能够在4周内有效地诱导和促进ESC分化为RPE细胞。研究［5］表明，通过在适当时间联合使用视网膜诱发因子（IGF1，Noggin，Dkk1和bFGF）和其他因子（NIC，Activin A，SU5402，血管活性肠肽），多能干细胞能够有效地定向分化成RPE细胞。Pmel17表达可使定向分化有效率高达80%以上。重要的是，早在分化开始后14 d，这些分化的RPE细胞就可以从干细胞分离出来以备使用。人包皮或腹部成纤维细胞具有维持人类ESC长期培养及诱导分化的潜能，可以作为滋养细胞用于ESC定向分化成具有特征性形态和分子标志物的RPE细胞［6］。这些培养技巧及培养方式的改进对于快速生成移植所需的充足、高质量的RPE细胞有着极为重要的意义。

2　诱导过程的标志与调控

在RPE分化中，miRNA下调与RPE特异基因上调相互关联［7］。有研究者希望通过mRNA和miRNA转录谱找出影响RPE定向分化的一组RPEmRNA和miRNA标志基因。为了解RPE分化过程中DNA甲基化所扮演的角色，研究者通过简化代表性重亚硫酸盐序列的方法检测基因组DNA甲基化模式，发现ESC/ iPSC在分化成RPE过程中甲基化及去甲基化呈4个阶段的动态波动。对DNA甲基化和RPE转录进行整合分析，发现DNA甲基化与miRNA和mRNA基因的亚型表达之间存在反向关联。基因本体论（gene ontolo⁃gy，GO）分析表明，发生动态甲基化改变的基因与RPE的分化和成熟有关。因此，DNA甲基化水平可以在一定程度上用来阐释人体多能干细胞转化为功能性RPE细胞的分化状态［8］。

细胞源性的微泡（microvesicles，MVs）被认为是细胞间联系的重要组成部分。将体外培养的人类Muller细胞每48 h连续暴露在鼠的ESC源性MVs（ESMVs）中，连续处理9次后，光镜下可见处理组细胞发生明显形态学变化，出现孤立的异形性细胞，而未处理组细胞呈均匀纺锤状融合成片。ESMVs能够将维持ESC多能性的mRNA转入到Muller细胞内［9］。

3　ESC眼部视网膜细胞定向分化及移植的相关动物模型

目前，在AMD和Stargardt病这类视网膜变性疾病的动物模型眼视网膜下腔进行RPE细胞移植的主要方法为在视网膜下腔推注hESC⁃RPE细胞悬液或植入hESC⁃RPE单层细胞植片。

3.1ESC眼部视网膜细胞定向分化相关动物实验

由光感受器缺失造成的不可逆失明临床上可望应用细胞替代疗法治疗。有研究表明，通过移植从分娩后幼鼠视网膜分离的光感受器前体细胞，可使视觉障碍的成年小鼠恢复部分视力。GONZALEZ⁃CORDERO等［10］采用三维分化的方式从小鼠的ESC中生成了神经视网膜，分离光感受器前体细胞以用于移植，并采用Rhop.GFP选择标记视杆前体细胞，证实其可以与成年视网膜变性小鼠的视网膜整合，在局部可进一步分化为成熟的含有外界膜盘的光感受器细胞；并提出发育阶段的ESC衍生的光感受器前体细胞与胎鼠生后4～8 d的光感受器细胞相似，比在其他阶段的细胞整合效率更高。

徐国彤等［3］的研究表明，在RCS大鼠视网膜下腔移植rESC分化的视网膜前体细胞（retinal progeni⁃tor cells，RPC），不仅移植细胞可以在局部存活，而且在移植早期即发挥了保护视网膜结构和功能的作用；在体外延长贴壁培养rESC来源的RPC的时间，仅能在移植后4周时轻度增加RCS大鼠视网膜ERG b⁃波的波幅，而在体外悬浮培养一定时间的rESC⁃RPC细胞却能够产生明显的神经元分化，移植后可显著地改善RCS大鼠的视觉功能。

在ESC培养和分化过程中，人类ESC与鼠ESC存在一定的区别。ESC体外培养分化可以形成视杯结构，人源性ESC分化的视杯结构比鼠ESC来源的视杯结构大，人源性ESC体外分化培养的神经视网膜结构很厚，而且会在顶部凸起部分自发卷曲，这在鼠的ESC培养分化中是看不到的。另外，人ESC源性神经视网膜可以分化出包含视锥和视杆的多层组织，而在鼠的培养中却几乎不能得到视锥的分化［11］。这些都体现了物种之间的差异，也为基础研究与临床研究的结合起到了警示作用。

3.2眼部视网膜细胞移植相关动物实验

ESC阻碍ESC应用于临床的核心问题就是潜在肿瘤形成的可能性。中国的研究者［12］对移植于小鼠视网膜变性模型中的多种ESC⁃RPCs进行评估，并对其全基因组基因的表达进行分析，发现Wnt信号通路介导的TCF7表达对成瘤性的调控具有关键作用。TCF7能够直接诱导Sox2和巢蛋白的表达。小鼠视网膜下腔移植的ESC⁃RPCs细胞内Sox2和巢蛋白的表达上调，可以显著降低移植细胞的成瘤性，提高移植细胞与视网膜的整合能力，并有效阻止小鼠的进行性视力减退。提示Wnt信号是ESC⁃RPCs致瘤性以及影响治疗性功能的重要因素。

4　研究者应继续关注的相关问题

ESC研究一直是一个颇具争议的领域。支持者认为，此类研究有助于解决很多疑难杂症，因为ESC可以分化成多种功能的多能细胞，被认为是挽救生命的尝试，是科学进步的表现。然而，反对者认为，进行ESC研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫内的生命形式，这会产生伦理问题，例如胚胎在植入前，是否应该与发育完善的人类具有相同的道德或者法律地位［13］。

目前，ESC研究已成为热点，而iPSC更是科学和医学研究的尖端领域。大量的动物和人类iPSC实验针对视网膜细胞移植治疗中移植细胞的安全性以及患者特异性、疾病特异性iPSC的安全性进行了广泛而深入的研究，为未来iPSC的临床应用奠定了基础。视网膜是研究神经再生的最佳模型。1项通过视网膜下电子假体进行视觉修复的临床试验表明，即使是存在严重变性病变的视网膜组织也可以在细胞移植后通过视觉系统的潜在可塑性拥有修复的能力。iPSC成功分化成神经视网膜组织及体外由人ESC分化形成视杯的成功案例增加了为人体临床试验提供可大量增殖、适应性强的细胞来源的可行性。在今后ESC眼部定向分化的基础以及临床试验中，利用iPSC衍生视网膜细胞作为临床治疗的可靠模型，以及将iPSC作为遗传性视网膜疾病患者进行临床细胞移植治疗的细胞来源，有着无限的发展前景。

［1］BETHESDA MD.What are embryonic stem cells?NIH Stem Cell Information Home Page.In Stem Cell Information［EB/OL］.［2016⁃09⁃21］http：//stemcells.nih.gov/info/basics/3.htm.

［2］SONG MJ，BHARTI K.Looking into the future：using induced plu⁃ripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling［J］.Brain Res，2016，1638（Pt A）：2-14.DOI：10.1016/j.brainres.2015.12.011.

［3］QU Z，GUAN Y，CUI L，et al.Transplantation of rat embryonic stem cell⁃derived retinal progenitor cells preserves the retinal structure and function in rat retinal degeneration［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6：219.DOI：10.1186/s13287⁃015⁃0207⁃x.

［4］MELLOUGH CB，SERNAGOR E，MORENO⁃GIMENO I，et al.Effi⁃cient stage⁃specific differentiation of human pluripotent stem cells toward retinal photoreceptor cells［J］.Stem Cells，2012，30（4）：673-686.DOI：10.1002/stem.1037.

［5］BUCHHOLZ DE，PENNINGTON BO，CROZE RH，et al.Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium［J］.Stem Cells Transl Med，2013，2（5）：384-393.DOI：10.5966/sctm.2012⁃0163.

［6］ZHANG YS，LU ZY，YU Y，et al.Derivation，culture and retinal pig⁃ment epithelial differentiation of human embryonic stem cells using human fibroblast feeder cells［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29（8）：735-744.DOI：10.1007/s10815⁃012⁃9802⁃2.

［7］HU G，HUANG K，YU J，et al.Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells［J］.PLoS One，2012，7（7）：e37224.DOI：10.1371/journal. pone.0037224.

［8］LIU Z，JIANG R，YUAN S，et al.Integrated analysis of DNA methyl⁃ation and RNA transcriptome during in vitro differentiation of hu⁃man pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells［J］. PLoS One，2014，9（3）：e91416.DOI：10.1371/journal.pone.009141 6.

［9］KATSMAN D，STACKPOLE EJ，DOMIN DR，et al.Embryonic stem cell⁃derived microvesicles induce gene expression changes in Müller cells of the retina［J］.PLoS One，2012，7（11）：e50417.DOI：10.1371/journal.pone.0050417.

［10］GONZALEZ⁃CORDERO A，WEST EL，PEARSON RA，et al.Pho⁃toreceptor precursors derived from three⁃dimensional embryonic stem cell cultures integrate and mature within adult degenerate ret⁃ina［J］.Nat Biotechnol，2013，31（8）：741-747.DOI：10.1038/ nbt.2643.

［11］NAKANO T，ANDO S，TAKATA N，et al.Self⁃formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs［J］. Cell Stem Cell，2012，10（6）：771-785.DOI：10.1016/j.stem.2012. 05.009.

［12］CUI L，GUAN Y，QU Z，et al.WNT signaling determines tumorige⁃nicity and function of ESC⁃derived retinal progenitors［J］.J Clin In⁃vest，2013，123（4）：1647-1661.DOI：10.1172/JCI65048.

［13］NAKAYA AC.Biomedical ethics［M］.San Diego：Reference Point Press，2011：96.

（编辑王又冬）

Differentiation of Pluripotent Stem Cells into Retinal Pigment Epithelium：Progress and Application

YAN Tingyu，KONG Jun
（Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，The Eye Hospital，China Medical University，Lens Science Research Key Laboratory of Liaoning Prov⁃ince，Shenyang 110005，China）

Eye is a type of sense organ enriched of nerves and histiocytes.In developed countries，retinal degeneration disorders such as age⁃relat⁃ed macular degeneration are the leading causes of irreversible vision loss.Dysfunction and damage of retinal pigment epithelium（RPE）and other related cells are the pathophysiological basis.So far，there was no efficient treatment to reverse the vision loss of this kind of diseases.The ongoing clinical trials of cell transplantation and genetic therapy are promising regimens in the future.Directed differentiation of embryonic stem cells（ESC）and induced pluripotent stem cells（iPSC）provides the possibility for the cell transplantation therapy，since these cells can be induced to almost all kinds of cells both in vitro and vivo.We summarized the progress and prospects in the field of inducing ESCs and iPSCs to differentiate into retina cells.

embryonic stem cell；induced pluripotent stem cell；eye；differentiation；retinal degeneration

R774.1

A

0258-4646（2016）11-0961-03

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.11.001

沈阳市科技局国际科技合作项目（140784）

颜廷宇（1991-），女，硕士研究生.

孔珺，E-mail：kongjun@hotmail.com

2016-09-12

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