视神经脊髓炎动物模型制备的研究进展

钟珊珊 何洋 刘广志



视神经脊髓炎动物模型制备的研究进展

钟珊珊 何洋 刘广志

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一种中枢神经系统(CNS)炎性脱髓鞘性疾病，目前主要认为是由水通道蛋白(aquaporin4，AQP4)抗体(即NMO-IgG抗体)所介导的自身免疫应答所致。目前NMO病因尚未完全明确，其动物模型的建立将有助于进一步开展发病机制和疾病干预的研究。因此，本文将对NMO的动物模型，包括NMO/实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型、NMO特异性抗体/补体经颅注射模型、细胞因子经颅注射模型和特异性AQP4反应性T细胞诱导模型的研究进展作一综述。

视神经脊髓炎；水通道蛋白4；视神经脊髓炎IgG；实验性自身免疫性脑脊髓炎

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)，亦称Devic病，是一种发生于中枢神经系统(CNS)炎性脱髓鞘疾病[1]。目前NMO病因尚未完全明确，多被认为是主要由“NMO-IgG”抗体 〔后经Lennon等[2]证实为水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)抗体(Ab)〕所介导的自身免疫应答所致，因此其动物模型的建立必将有助于更深入地开展发病机制和疾病干预的研究。目前针对鼠科动物已成功地建立了多种诱导NMO的方法，包括NMO/实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型、NMO特异性抗体/补体(AQP4 Ab/C)经颅注射模型、细胞因子经颅注射模型和特异性AQP4反应性T细胞诱导模型等。据此，本文针对上述NMO动物模型制备的进展作一综述。

1 NMO发病机制及临床、病理学特点

2004年Lennon等[2]报道于NMO患者体内发现一种特异性抗体“NMO-IgG”，随后经细胞免疫荧光法证实其靶抗原为AQP4。目前认为NMO的发病机制过程可能为：某外源性抗原激活免疫系统AQP4反应性T细胞，促使B细胞产生AQP4 Ab，透过血-脑屏障(blood brain barrier，BBB)与位于星型胶质细胞足突上的AQP4分子结合，激活补体级联反应，破坏BBB完整性，导致AQP4抗体以及其他致病因子进入至CNS内，激活中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，从而产生血管周围炎性反应并进一步损害少突胶质细胞，最终导致CNS组织破坏[3]。

NMO临床上主要表现为急性横贯性或播散性脊髓炎，同时或继发视神经炎。病理学上表现为脊髓较长节段的广泛脱髓鞘并伴有坏死和囊样改变、轴索损伤，典型病变位于脊髓中央部位，而周边髓鞘保留。镜下显示为病灶内血管数量增加、管壁增厚，少突胶质细胞显著脱失，轴索肿胀和变性；在急性活动性病灶内，有大量炎性细胞浸润，血管周围可见由抗体(主要是IgM)和补体聚集成的“玫瑰花环”样改变及血管壁的玻璃样变性[2]。视神经或视交叉处可见肿胀或增粗、髓鞘脱失和轻度的炎性细胞浸润[3]。

2 NMO动物模型

2.1 NMO/EAE模型 此模型制备原理是在EAE模型基础上，进一步将特异性AQP4 Ab注入实验动物体内以诱导NMO发生。众所周知，EAE是由特异性致敏T细胞介导的CNS脱髓鞘性自身免疫病，可经主动免疫或被动免疫两种诱导方式，前者是将溶解于佐剂的MS特异性抗原〔如髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)〕注入动物体内，诱发抗原特异性T细胞产生；后者是将已被特异性抗原激活的特异T细胞转移至特定基因敲除鼠体内进行诱导。当动物出现EAE临床症状(如体质量减轻、肢体瘫痪等异常行为)时，提示鼠BBB的通透性改变，进一步向脑组织内注入人AQP4 Ab即可致病。

NMO/EAE模型主要制备步骤：(1)EAE模型的诱导，视动物品系采用不同的诱导抗原肽段，Lewis大鼠选择MBP68-86或MBP82-99肽段[4]，C57BL/6小鼠则多为MOG35-55[5]。Lewis大鼠采用不完全福氏佐剂(IFA)加入结核分枝杆菌制备成完全福氏佐剂(CFA)，而后与等体积含MBP磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)混匀制备免疫乳剂，通过尾静脉注入体内[6]；C57BL/6小鼠则将MOG35-55稀释，与CFA混匀后制成油包水乳状抗原，于背部脊柱两侧分四点皮下注射MOG抗原，百日咳毒素(PTX)可同时及48 h后腹腔内注射[5]。(2)NMO模型的建立：在免疫后10～14 d，Lewis大鼠刚开始出现EAE临床病情变化(如尾部无力拖垂、步履蹒跚、后肢瘫痪和行走困难等表现)，连续4 d于大鼠腹腔内注射10 mg NMO患者IgG，即可诱导出NMO症状[7]。

与EAE模型不同，成功建立NMO/EAE模型的Lewis大鼠CNS病变区域镜下可见AQP4 Ab特异性结合于星型角质细胞表面，与沉积于血管周围的补体形成类似NMO患者的特征型的“玫瑰花环”样改变，进一步引起星型胶质细胞的破坏等变化，后期可见及髓鞘变性和脱失[7-8]。

NMO/EAE模型是一种研究NMO较为理想的模型，但仍存在一定局限性。首先，制作该模型需要较高剂量的NMO患者IgG，每只Lewis大鼠需10 mg/d[6]，C57BL/6小鼠则需2 mg/d[9]。其次，人鼠间存在致病性T细胞亚群的差异[7]，如Lewis鼠由Ⅰ型辅助性细胞(Th1)介导，而人类亦可由Th17致病，因此，利用大鼠NMO/EAE模型并不能完全模拟人体NMO的发病机制。

2.2 AQP4 Ab/C经颅内注射诱导的NMO模型 此模型制备原理是将人AQP4 Ab及补体直接注入鼠大脑半球或脑室内致病，而毋须BBB通透性改变。制备步骤如下：将分离获取的AQP4 Ab阳性NMO患者的IgG，用PBS稀释为浓度为6～38 mg/mL，取16.8 μL IgG和11.2 μL人补体，利用脑立体定位仪定位，对野生AQP4免疫缺陷小鼠行脑室内注射，即可诱导出NMO症状[8]。

注射后12 h可见小鼠AQP4表达下降、星型胶质细胞水肿、髓鞘崩解和轴索破坏[3]；7 d后可见血管周围大量的补体沉积、星型胶质细胞数目减少、长节段的髓鞘脱失、神经元坏死和大量的炎性细胞浸润，以单核和多核粒细胞为主。

此模型毋须T细胞激活，将人AQP4 Ab和补体注入T细胞缺失裸鼠，亦可见炎性细胞聚集、AQP4表达减少和髓鞘脱失[8]。相对于NMO/EAE模型，此模型对AQP4 Ab需求量较低，但亦有一定局限性，如单凭人抗体无法结合和激活鼠补体系统，须同时添加人补体，从而无法模拟生理状态下鼠补体激活以及产生补体抑制因子的过程。此外，反复多次脑内注射亦会影响CNS组织对炎性刺激的敏感性[4]。

2.3 细胞因子经颅内注射诱导的NMO模型 此模型制备原理是基于Bradl等[3]提出的“在AQP4 Ab和补体存在的前提下，促炎性细胞因子亦会促进损伤形成”的观点。对血清学AQP4 Ab阳性的Lewis大鼠分别经颅骨注射多种细胞因子，包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素-γ和趋化因子CXCL2等，其中IL-1β可成功诱导NMO模型。制作此模型可选用3周(未成年)和7周(成年)野生Lewis大鼠，将100 ng/μL IL-1β溶于无肉毒素的PBS溶液，取0.3 μL通过立体定位仪定位注射至AQP4 Ab阳性鼠的纹状体内[11]即造模成功。

注射24 h后，病理学观察可发现注射半球(包括皮层、胼胝体、纹状体、丘脑)白细胞的迁移及聚集、血管周围中性粒细胞浸润区域AQP4表达降低和补体介导的细胞损伤，表明IL-1β改变了BBB的通透性，从而使外周血中的AQP4 Ab渗入注射大脑半球内而引起CNS损伤；而且相对于活动期MS，NMO损伤区域激活的小胶质细胞/巨噬细胞含有更多的IL-1β，表明IL-1β作为重要的继发因子在CNS损伤形成和炎性细胞聚集的过程中发挥重要作用[11]。此模型利于研究炎性细胞因子对AQP4 Ab阳性鼠CNS损害的致病作用，并为细胞因子的治疗提供依据，不足之处是对CNS的外科操作要求较高。

2.4 AQP4反应性T细胞诱导的NMO模型 此模型制备原理是基于在抗原特异性T细胞针对CNS的免疫攻击发生后，AQP4 Ab进一步促进补体激活和炎性细胞聚集而加重NMO症状。AQP4在细胞膜上形成稳定的四聚体由6个跨膜螺旋片段及2个非跨膜螺旋片段组成，研究证实其中AQP4 C环(AQP4135-53)肽段可激活AQP4免疫缺陷鼠CNS内T细胞[12-13]。此模型制备步骤：将合成的人AQP4 C环肽段，用PBS缓冲液稀释为2 mg/mL，与8 mg/mL CFA等体积混合，取100 μL通过尾静脉注入AQP4表达缺陷的C57BL/6小鼠体内，同时及48 h后腹腔内注射PTX。注射AQP4 C环肽段23 d后，取小鼠脾脏获取AQP4特异性T细胞并连续培养3 d，随后将培养的AQP4特异性T细胞(约5×106)通过尾静脉注入野生型鼠体内，5 d后观察可见注射鼠体质量减轻、肢体瘫痪等症状[8]，即造模成功。造模成功14～21 d后，免疫组织化学染色可见脊髓、视神经和脑内的AQP4的丢失、髓鞘脱失以及T细胞聚集等NMO样改变。

有趣的是，在AQP4特异性T细胞诱导过程中，若加以IL-6和IL-23刺激，可诱导Th17的产生，同法注入则可出现更为严重的髓鞘脱失和神经功能缺损，包括四肢无力、偏瘫和体质量减轻等症状[14]。此模型证实AQP4反应性T细胞导致行为障碍和CNS少突胶质细胞损害的潜在作用，利于尝试针对AQP4抗原的特异性免疫治疗，且高剂量AQP4 C环肽段注射诱导的免疫耐受已被认为是NMO治疗的一个新方向[15]。但因其操作步骤较多，精细度要求较高，成功率低于前述方法。

3 目前NMO动物模型存在的问题

3.1 人类和啮齿类动物的星形胶质细胞特点迥异 人类和啮齿类动物星形胶质细胞均表达AQP4，而人类除AQP4外亦表达AQP1，在AQP4缺失时可发挥代偿作用[16]。另外，人类每个星型胶质细胞可支持和调节约2百万个突触的功能，而啮齿类仅为9万个左右[17]。

3.2 人类和啮齿类动物外周血白细胞比例不同 人类中性粒细胞占外周血白细胞总数〔(4.0～10.0)×109/L〕的45%～75%，Lewis大鼠约占35%[17]，小鼠则为5%～27%[18]。中性粒细胞的比例差异决定了损伤部位AQP4表达改变程度的不同。

总之，尽管NMO模型的制备迄今已取得了很大进展，但仍存在不少问题或疑点，如目前NMO模型大多通过持续、反复、多部位注射AQP4 Ab获得，不同遗传背景的鼠系NMO模型临床和病理学表现迥异等问题，均须今后开展更多的工作予以确证。

[1]Lennon VA，Wingerchuk DM，Kryzer TJ，et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica： distinction from multiple sclerosis[J]. Lancet，2004，364： 2106-2112.

[2]Lennon VA，Kryzer TJ，Pittock SJ，et al. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel[J]. J Exp Med，2005，202：473-477.

[3]Bradl M，Misu T，Takahashi T，et al. Neuromyelitis optica： pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo[J]. Ann Neurol，2009，66：630-643.

[4]Bradl M，Lassmann H. Experimental models of neuromyelitis optica[J]. Brain Pathology，2014，24：74-82.

[5]穆阳，赵晖，刘妍，等. 不同剂量MOG抗原免疫诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型的比较[J]. 中国实验动物学报，2010，2：18-21.

[6]Makoto Kinoshita A，Yuji Nakatsuji A. Neuromyelitis optica：Passive transfer to rats by human immunoglobulin[J]. Biochem Biophys Res Commun，2009，386：623-627.

[7]Nelson PA，Khodadoust M，Prodhomme T，et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4，the autoantigen associated with neuromyelitis optica[J]. PLoS ONE，2010，5：e15050.

[8]Saadoun S，Waters P，Bell BA，et al. Intra-cerebral injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G and human complement produces neuromyelitis optica lesions in mice[J]. Brain，2010，133 (Pt 2)：349-361.

[9]Chan KH， Zhang R， Kwan JS， et al. Aquaporin-4 autoantibodies cause asymptomatic aquaporin-4 loss and activate astrocytes in mouse[J]. J Neuroimmunol，2012，245 (1-2)：32-38.

[10]Jones MV， Huang H， Calabresi PA，et al.Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica[J].Acta Neuropathol Commun，2015，3：28.

[11]Kitic M，Hochmeister S，Wimmer I，et al. Intrastriatal injection of interleukin 1 beta triggers the formation of neuromyelitis optica-like lesions in NMO-IgG seropositive rats[J]. Acta Neuropathol Commun，2013，1：5.

[12]Matsuoka T，Suzuki SO，Suenaga T，et al. Reappraisal of aquaporin-4 astrocytopathy in Asian neuromyelitis optica and multiple sclerosis patients[J]. Brain Pathol，2011，21：516-532.

[13]Popescu BF，Lucchinetti CF. Pathology of demyelinating diseases. Annu Rev Pathol，2012，7：185-217.

[14]Vaknin-Dembinsky A，Brill L，Kassis I，et al. T-cell reactivity against AQP4 in neuromyelitis optica[J]. Neurology，2012，79：945-946.

[15]Varrin-Doyer M，Spencer CM，Schulze-Topphoff U，et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter[J]. Ann Neurol，2012，72：53-64.

[16]Pohl M，Fischer MT，Mader S，et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4[J]. Acta Neuropathol (Berl)，2011，122：21-34.

[17]Oberheim NA，Wang X，Goldman S，et al. Astrocytic complexity distinguishes the human brain[J]. Trends Neurosci，2006，29：547-553.

[18]Boxio R， Bossenmeyer-Pourie C， Steinckwich N， et al. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils[J]. J Leukoc Biol， 2004，75(4)：604-611.

(本文编辑：邹晨双)

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.04.012

100044北京大学人民医院神经内科(钟珊珊、何洋、刘广志)

刘广志，Email：guangzhi2002@hotmail.com

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