DNA甲基化在常见眼科疾病中的研究进展

杜钰　竺向佳　卢奕



·综述·

DNA甲基化在常见眼科疾病中的研究进展

杜钰竺向佳卢奕

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科上海200031

【摘要】表观遗传学是近年新兴起的有别于传统遗传学的一门学科。它通过DNA甲基化、组蛋白共价修饰、非编码RNA调控等方式改变基因表达或细胞表型，这一改变能够遗传给子代，但DNA序列并未发生变化。DNA甲基化作为一种表观遗传学的重要机制，已被证实在大量复杂生命现象，比如衰老、氧化应激中起到作用。以往DNA甲基化的研究主要着重于全身性疾病，而在眼科领域的应用才刚刚兴起。本文重点介绍DNA甲基化在眼科常见疾病中的研究进展。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：60-64)

【关键词】表观遗传学；DNA甲基化；眼科疾病

表观遗传学是近年发展起来的有别于传统遗传学的一门遗传学分支学科，它是功能基因组学的重要组成部分，研究在不改变DNA序列的前提下，对基因表达所进行的可遗传修饰改变。其主要机制包括：①DNA甲基化；②组蛋白共价修饰；③非编码RNA调控；④基因印迹等。其中DNA甲基化是研究较多的表观遗传现象。具体指在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为供体，将甲基添加到富含胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列中胞嘧啶5号碳原子上，从而形成5-甲基胞嘧啶。甲基位于DNA双螺旋的大沟内，通过吸引或排斥各种DNA结合蛋白来发挥对基因表达的调控作用。通常DNA胞嘧啶甲基化与基因沉默有关，而去甲基化则与基因活化有关。已有大量研究证实DNA甲基化在衰老、氧化应激、炎症等复杂的生命事件中起了重要作用。常见眼科疾病中发病机制未完全明确者，常常是受到遗传、表观遗传、环境等的多重影响。研究DNA甲基化这一主要表观遗传机制在眼科疾病中的作用，有助于进一步了解复杂眼病的机制，并为尚无理想治疗方法的眼病提供新的治疗思路。

1DNA甲基化与白内障

白内障是全球范围内的首要致盲眼病，根据病因的不同可分为老年性白内障、并发性白内障、代谢性白内障等，病理机制仍未完全阐明。近几年的研究发现各类白内障的发生、发展都与DNA甲基化有着密切的联系。1.1年龄相关性白内障年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)是晶状体受到环境、营养、代谢和遗传等多重因素长期综合作用后在中老年开始发生的晶状体浑浊，发病因素十分复杂。目前认为是氧化应激引起了白内障的最早期变化[1-3]。

α-晶状体蛋白是晶状体的主要结构蛋白之一，由A、B 2个亚基组成，是晶状体内抗氧化机制的重要组成，在维持晶状体的透明中起着关键作用[4-5]。Zhou等[6]研究了年龄相关核性白内障和年龄匹配的正常透明晶状体上皮细胞中αA-晶状体蛋白基因(CRYAA)的表达，发现在年龄相关核性白内障晶状体上皮细胞中CRYAA表达明显下调，且CRYAA基因启动子上游-856～-640 bp序列中有6个CpG位点较对照组呈明显的高甲基化。经DNA甲基转移酶抑制剂zebularine处理过的人晶状体上皮细胞，其CRYAA mRNA和蛋白质产物的量较对照组有所提高[6]。这项研究表明DNA甲基化对CRYAA表达的下调在年龄相关核性白内障的形成中起了重要作用。

多数氧化应激导致的DNA损伤可以被相关酶类修复，其中包括8-氧鸟苷酸DNA糖苷酶(OGG1)[7]。Wang等[8]对OGG1的表达在修复晶状体细胞氧化损伤中的保护作用进行了验证，并对年龄相关性皮质性白内障患者晶状体皮质中DNA甲基化和OGG1的表达情况进行了研究。通过qRT-PCR、Western印迹及免疫荧光等方法，得到ARC患者晶状体皮质中提取出的DNA中OGG1基因第1个外显子的CpG岛呈现高甲基化，OGG1 mRNA与蛋白质水平较对照组明显减少，ARC皮质中OGG1阳性的细胞比例也明显下降等结果。利用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC诱导体外培养的人晶状体上皮DNA去甲基化后，发现OGG1表达上调[8]，说明在ARC患者晶状体皮质中，OGG1表达会减少，且与OGG1基因启动子CpG岛的高度甲基化相关。

为了减少随着年龄增长逐渐加重的氧化应激损伤，机体会诱导生成一系列保护性蛋白。核因子E2相关因子 (Nrf2)是能够激活多种抗氧化酶的中心物质，而kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap1)是Nrf2的抑制剂，促进Nrf2的蛋白酶解[9]。Nrf2/Keap1依赖性抗氧化保护系统在维持晶状体透明中起着重要作用。Gao等[10]对人晶状体细胞进行特定基因DNA甲基化分析发现随着年龄的增大(60～88岁)，Keap1基因启动子区域甲基化水平逐渐下降，Keap1的基因表达产物增多，继而晶状体内抗氧化能力下降，提示DNA甲基化对Keap1基因启动子的调控可能在ARC的发生中发挥了作用。

1.2代谢性白内障随着糖尿病在全球范围内患病率的日益增加，糖尿病性白内障的发病率显著上升，分为真性糖尿病性白内障和假性糖尿病性白内障，其中假性者与老年性白内障很相似，只是发病率较高、发生较早、进展较快。Palsamy等[11]研究了糖尿病患者白内障晶状体中CpG岛甲基化与正常透明晶状体之间的差别，发现较透明晶状体而言，糖尿病患者的白内障晶状体中Keap1基因启动子亦呈明显去甲基化；而用去甲基化药物5-Aza处理人晶状体上皮细胞株，得到Keap1mRNA增加9倍、蛋白质增加2倍的结果。Keap1基因启动子低甲基化引起其表达的上调导致Nrf2所介导的抗氧化保护作用受抑制，晶状体原本的氧化还原平衡被打破，处在更高水平的氧自由基环境，进而促发晶状体的浑浊[3, 10-12]。这一机制与糖尿病性白内障的形成或许有着密切的联系，然而高血糖是通过怎样的途径影响晶状体上皮细胞基因DNA甲基化的程度进而促使白内障的早发有待进一步研究探索。1.3高度近视性白内障高度近视是屈光度>-6.00 D或眼轴>26 mm的近视类型，它与白内障发生的关联已被若干研究证实[13-15]。高度近视患者并发性白内障多为核性白内障，且多见棕黑色硬核。关于其中的DNA甲基化机制的研究有很多，但目前仅检索出一篇文献。Zhu等[16]对白内障手术患者晶状体上皮细胞中CRYAA启动子区域CpG岛甲基化程度进行分析发现，高度近视性白内障LOCS Ⅲ核分级NC5-6者CRYAA启动子CpG岛呈高度甲基化，且αA-晶状体蛋白表达水平明显低于相同核分级年龄相关性白内障患者和高度近视无白内障患者。该研究提示高度近视是黑色核性白内障的危险因素，CRYAA启动子CpG岛的高度甲基化引起其表达的下调，可能在高度近视患者较普通人白内障更早发，且在易发硬核性白内障中起了作用。

2DNA甲基化与视网膜疾病

视网膜是眼球后部最内层组织，结构精细、功能复杂，极易受到内外致病因素的影响而引发病变。随着表观遗传学的发展，DNA甲基化在视网膜变性疾病中的研究正在逐步深入。

2.1年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是60岁以上老人视力损害不可逆的首要原因，以黄斑区视网膜组织退行性病变为主要表现。病理、生理特点包括视网膜玻璃膜蛋白质、脂质沉积——玻璃膜疣(drusen)的形成，视网膜色素上皮细胞营养代谢障碍，黄斑区色素紊乱，最终导致中心视力减退，甚至丧失。

已有大量研究[17-21]证实氧化应激参与了AMD的发生，且该过程应该受到了表观遗传学调节。有研究[22-23]对同卵双胞胎关于AMD的相关基因型与AMD表型进行分析后都得到：基因在一定程度上决定了AMD的易感性，然而疾病真正的发生过程及最后的视力转归受到环境因素更大的影响，提示表观遗传机制参与了AMD的发生、发展。Hunter等[24]对AMD患者和年龄匹配正常人的视网膜色素上皮细胞和睫状体进行全基因甲基化图谱分析，发现AMD患者2种谷胱甘肽S转移酶同工酶Gstm1和Gstm5基因启动子区域高甲基化，且视网膜神经感觉层中这2种抗氧化酶的表达明显少于对照。证实在AMD患者的视网膜色素上皮和睫状体中，Gstm1和Gstm5的表达被DNA甲基化下调，提高了黄斑对氧化应激损伤的易感性，促发了AMD的形成[24]。

而氧化应激对视网膜的损伤是由炎症反应来介导的，炎症反应加速drusen的形成，促使AMD的发生[25-26]，炎症因子IL-17、IL-2等参与其中[26]。 Liu和Wei等[27]发现AMD患者血清中IL-17，IL-2等炎症因子水平较非AMD人群高，并进一步对AMD患者外周血单核细胞中231个基因启动子区域的CpG岛进行甲基化分析，发现AMD细胞内IL-17RC启动子区域呈明显低甲基化，对应黄斑中IL17-RC基因的转录水平升高，IL-17RC阳性的单核细胞数目增多使得AMD患者对IL-17所介导的炎症反应更为敏感[28]，进而得到IL17RC基因启动子区域低甲基化和AMD发病的确切关系。

clusterin/apolipoprotein J是体内各组织器官普遍存在的一种糖蛋白，是细胞遭受氧化应激的一个生物标记[29]，在氧化应激中对细胞有保护作用[30-31]，同时也是drusen中的主要沉积物[32-34]。研究发现随着年龄增长，丝生蛋白(clusterin)在眼内的表达增多，正如drusen在视网膜色素上皮下的逐渐形成。Suuronen等[35]使用脱氧氮杂胞苷(5-Aza)，一种DNA甲基化转移酶抑制剂，作用于人视网膜色素上皮细胞诱导其DNA去甲基化，得到clusterin mRNA和蛋白质的显著增加，而且其分泌也明显增加，提示clusterin基因中CpG岛甲基化水平的下降或许参与了AMD的形成。

2.2糖尿病性视网膜病变糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是最常见的视网膜微血管病变。高血糖对视网膜内皮细胞线粒体DNA,尤其是D-loop结构造成损害，使得细胞受损死亡，并形成一个恶性循环，导致血糖恢复正常后DR的持续进展[36-38]。受损DNA的碱基错配可被DNA聚合酶γ亚基1(POLG1)所修正，然而Tewari等[37, 39]对大鼠糖尿病模型进行了一系列实验，发现其视网膜内皮细胞POLG1基因调控序列CpG岛在高血糖和血糖恢复正常后都呈现持续高甲基化状态，POLG1表达持续下调，线粒体DNA复制体系功能障碍。提示DR的发生与持续进展同POLG1基因启动子CpG岛高甲基化有关，且通过药物或分子手段对DNA甲基化进行调适以维持线粒体稳态也许可以成为一种新的DR治疗思路。

2.3视网膜色素变性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一组遗传眼病，属于光感受器细胞及视网膜色素上皮细胞营养不良性退行性病变。目前尚无有效治疗。最近的研究[40]结果发现，DNA甲基化参与了光感受器细胞的死亡和凋亡过程。Farinelli等[41]发现在啮齿类动物RP模型rd1,rd2,P23HS334ter中，光感受器细胞死亡时DNA中胞嘧啶甲基化水平较野生型非RP模型有所升高；对光感受器细胞进行超微结构观察，发现在视网膜变性过程中染色质构型发生改变，且与此同时检测到的细胞内一种DNA甲基转移酶DNMT3a的表达增加。进一步实验后，发现rd1模型小鼠中几个细胞死亡相关基因的转录因子结合位点较野生型小鼠甲基化水平明显较高，且相对应的基因转录活性有所下降。不过需要注意的是，这些基因的表达是否是光感受器细胞特异的或与RP相关仍需进一步研究明确。用decitabine——一种DNA甲基转移酶抑制剂作用于rd1小鼠后，其光感受器细胞的死亡明显减少[41]，为RP提供了一种可能的表观遗传学治疗方法。

3DNA甲基化与青光眼

青光眼是一组由眼压病理性升高所导致的疾病，以视神经萎缩和视野缺损为共同特征。一般分为原发性、继发性和先天性三大类，根据眼压升高时前房角的状态又可分为闭角型青光眼和开角型青光眼。继发性青光眼的发病因素一般比较明确，原发性青光眼中以开角型较为多见，且表观遗传学研究最多。

原发性开角型青光眼病因尚不完全明了,遗传、表观遗传和环境等因素在其中都起到了一定作用[42-45]。Jünemann等[46]提取原发性开角型青光眼患者外周血单核细胞中DNA并进行全基因DNA甲基化水平分析，发现较继发性青光眼和非青光眼人群明显升高，提示DNA甲基化可能参与了原发性开角型青光眼的发生，但具体机制还需针对特定基因甲基化状态进行研究以明确。

目前认为小梁网结构的改变会引起房水引流系统的异常、眼压增高，继而导致青光眼一系列的病理改变[47-48]。促纤维化因子TGF-β促进细胞外基质(ECM)的生成[49-50]，而ECM在小梁网和视神经乳头筛板的过多沉积会阻碍房水回流并使视神经受到压迫而发生病变[51-52]。现已明确原发性开角型青光眼患者房水中TGF-β的含量高于正常对照人群[50,53]，且DNA甲基化在肺、卵巢等器官中提高了TGF-β的促纤维化作用[54-56]。DNA甲基化与TGF-β、ECM在原发性开角型青光眼中增多的关系有待进一步的研究证实。

4DNA甲基化与眼部肿瘤

眼科学中最常见的肿瘤包括视网膜母细胞瘤及葡萄膜黑色素瘤，其中视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，而葡萄膜黑色素瘤则是成年人中最常见的眼内恶性肿瘤。对于这2种疾病的发生与转归，已有大量围绕DNA甲基化机制的研究，其中已发现许多抑癌基因启动子区域CpG岛的高度甲基化与基因沉默的相关性，且该机制参与这2种肿瘤的发生。

Ras相关区域家族1A(RASSF1A)是一个常见的肿瘤抑制基因，在正常组织中的甲基化发生率非常低，而在视网膜母细胞瘤及葡萄膜黑色素瘤中被证明在启动子区域的甲基化率高达89%[57]和70%[58]。Choy等[59]在一系列实验中发现，视网膜母细胞瘤中，RASSF1A基因启动子区甲基化程度越高，其mRNA表达水平越低；而经5-Aza处理后的细胞株该基因的表达有所恢复。Maat等[60]在实验中发现RASSF1A基因启动子的甲基化可能与葡萄膜黑色素瘤的转移相关。

此外，O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因、视网膜母细胞瘤样蛋白2(RBL2)基因等抑癌基因也被证明，其启动子的高度甲基化与视网膜母细胞瘤的发生、发展紧密相关[59, 61]。hTERT、TIMP3等抑癌基因启动子的高甲基化与葡萄膜黑色素瘤的发生与转移相关[62-63]。

5总结与展望

许多眼部疾病的发生，包括老年性白内障、年龄相关性黄斑变性、青光眼及眼部肿瘤等都受到环境因素的影响，而表观遗传模式的改变很可能就是联系环境影响因素与基因表达之间的桥梁。尽管目前对DNA甲基化在眼科常见疾病中作用的认识还处于很初步的阶段，但毋庸置疑它在许多眼病的发生、发展过程中十分重要。如果能进一步明确各病具体的甲基化位点，并解决给予DNA甲基转移酶及其抑制剂治疗时的非靶向作用的困扰，相信在将来，DNA甲基化会为临床预防、诊断及治疗眼病打开新的思路并发挥重要作用。

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(本文编辑诸静英)

The research progress of DNA methylation in common ocular diseases

DUYu,ZHUXiang-jia,LUYi.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,ChinaCorresponding author： LU Yi, Email: luyieent@126.com

【Key words】Epigenetics; DNA methylation; Ocular diseases

【Abstract】Epigenetics is an emerging discipline studying the heritable regulation of gene function and celluar phenotype by means of DNA methylation, histone modification and non-coding RNA without changing DNA sequence, which is different from the traditional genetics. Being one of the most important mechanisms in epigenetics, DNA methylation is involved in a large number of complex biological phenomena, such as aging, oxidative stress, etc. Previously, the study of DNA methylation were mostly focused on systemic diseases, while in ophthalmology it just started. This article is an review of the research progress of DNA methylation in common ocular diseases. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:60-64)

通讯作者：卢奕(Email: luyieent@126.com)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.01.022

(收稿日期2015-01-26)