RFRP-3/GPR147信号通路在哺乳动物生殖系统中作用的研究进展

韩兴绘，　俞建



性早熟专栏

RFRP-3/GPR147信号通路在哺乳动物生殖系统中作用的研究进展

韩兴绘，俞建

201102上海，复旦大学研究生学院(韩兴绘)；复旦大学附属儿科医院中医科(俞建)

【摘要】哺乳动物生殖系统的各项功能依赖于下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴的调控，是多种因子参与的复杂的生物学过程。RFRP-3是目前下丘脑中唯一已知的HPG轴抑制因子。近年来大量研究发现，RFRP-3能与其受体GPR147结合，抑制促性腺激素释放激素、促黄体生成素的合成与分泌，进而影响生殖系统的功能。本文总结近十年有关哺乳动物RFRP-3/GPR147信号通路的研究，并系统阐述RFRP-3 对 HPG 轴的可能调控机制以及其在生殖系统中的作用。

【关键词】性发育；RFRP-3；GnRH；LH；生殖系统

哺乳动物生殖系统功能受下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadaxis，HPG)轴的调控，下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神经元脉冲样分泌GnRH到垂体门脉系统中，刺激垂体促性腺激素(gonadotropic hormone，GTH)大量合成与分泌，进而促进外周性腺分泌性激素，从而调控生殖系统的各项生理活动。各种因素可以通过多种神经内分泌系统作用于GnRH神经元，影响HPG轴，进而影响生殖系统。2000年，Tsutsui等[1]在日本鹌鹑大脑中初次发现一种能抑制GTH释放的下丘脑多肽，将其命名为GTH抑制激素(gonadotropin-inhibitoryhormone，GnIH)。随后Hinuma等[2]又在哺乳动物中发现与GnIH同源的下丘脑神经肽-RF酰胺相关肽(RFamide-relatedpeptide，RFRP)，它是到目前为止发现的唯一一个对HPG轴起负调控作用的下丘脑神经肽。大多数哺乳动物RFRP基因编码两条有生物活性的短肽RFRP-1和RFRP-3[2]。而人类RFRP基因编码3条短肽，即RFRP-1、RFRP-2、RFRP-3[2]。其中，RFRP-3在生殖系统的调控过程中发挥了重要的抑制作用，关于它的研究也最多。笔者将对近年来关于RFRP-3在生殖系统中的作用做一个全面的综述。

1下丘脑RFRP-3神经元的位置及纤维投射

鸟类的GnIH神经元胞体主要聚集在下丘脑背内侧核，也有一些分散在下丘脑腹内侧核与背内侧核之间的后部[1]。其神经纤维在下丘脑广泛分布，其中在正中隆起处最为密集，这个区域同时存在很多GnRH神经元及其纤维。在大部分哺乳动物中，RFRP-3神经元胞体也主要集中在下丘脑背内侧核。2006年Kriegsfeld等[3]利用原位杂交技术发现仓鼠RFRP-3神经元细胞体主要聚集在下丘脑背内侧核，小鼠和大鼠RFRP-3神经元在下丘脑的分布与之相似。2009年Rizwan等[4]利用细胞免疫染色在大鼠上证实了这一点。人类RFRP-3神经元胞体也主要集中在下丘脑背内侧核[5]。而绵羊RFRP-3神经元大部分聚集在下丘脑腹侧室旁核，罕有扩散到背内侧核[6]。

RFRP-3神经纤维广泛投射到下丘脑杏仁核中部、室旁核、视前区中部等区域，不同物种之间投射区域略有差异。多项研究显示哺乳动物RFRP-3神经元也与GnRH神经元结构上密切联系。2007年Johnson等[7]发现75% GnRH神经元与RFRP-3神经元接近。另一研究发现，仓鼠超过40% GnRH神经元胞体接受RFRP-3神经纤维突触传递[3]。2012年Rizwan等[8]发现雄性小鼠及动情间期雌性小鼠大约26% GnRH神经元有RFRP-3神经纤维投射。在绵羊上也发现GnRH神经元与RFRP-3神经元存在共定位[9]。人类RFRP-3神经元与GnRH神经元接近，但具体联系的神经元数未被定量[5]。这些分布特点显示RFRP-3有可能在下丘脑水平通过抑制GnRH神经元进而抑制GTH的释放。在仓鼠和绵羊以及包括人类在内的灵长类动物上发现，RFRP-3神经纤维可投射到正中隆起的外部区(神经内分泌区域)[3,6,10]，但是在大鼠上未发现类似的投射[4,7]。这些分布特点提示在这些动物中RFRP-3可能分泌到垂体门脉系统直接作用于垂体，在垂体水平抑制GTH的释放。另外，研究还发现在大鼠或小鼠下丘脑，RFRP-3神经纤维可投射到kisspeptin神经元，提示RFRP-3可能调控Kiss-1基因表达[7-8,11]。RFRP-3神经纤维还可以直接投射到神经肽Y神经元以及促生长激素释放激素神经元上[7]。

2RFRP-3的受体

RFRP-3的受体是G-蛋白偶联受体147(G-protein coupled receptor，GPR147)[2]。GPR147在哺乳动物下丘脑高表达，可表达在下丘脑GnRH及kisspeptin神经元上。2012年Rizwan等[8]发现小鼠下丘脑33%GnRH神经元及室旁核9%～16% kisspeptin神经元表达GPR147。2013年Poling等[11]发现小鼠下丘脑前腹侧室周核5%～10%、弓状核约25% kisspeptin神经元表达GPR147受体。GPR147在垂体、中脑、髓质、眼睛及睾丸也表达[2]。但是在垂体上的表达水平目前还不是特别清楚，可能跟物种有关。在绵羊垂体上发现GPR147有表达[10,12]。在人类脑垂体上，最初研究认为GPR147表达水平很低，仅仅可检测到[13]。但后来，Ubuka等[5]发现GPR147在垂体上明显表达。大鼠上，Hinuma等[2]认为GPR147在下丘脑高表达，但是在脑垂体上无表达。然而，同期Bonini等[13]研究认为GPR147在大鼠垂体上也高表达。目前的研究认为虽然大鼠脑垂体上表达GPR147，但是大鼠RFRP-3神经元很少投射到正中隆起神经内分泌区，可能很少直接作用于垂体[14]。

3影响RFRP-3表达及分泌的因素

目前，调控RFRP-3神经元的潜在机制尚不清楚。近年来研究发现RFRP-3表达变化可能与个体发育阶段、雌激素、光周期变化及压力相关。在小鼠及大鼠上的研究发现，在不同的生长发育阶段，下丘脑RFRP-3的表达水平发生变化，但是关于变化趋势的观点目前还不是完全统一。无论雌性还是雄性大鼠，青春发育期与幼年期(出生后2周)相比，RFRP-3表达均明显升高。Iwasa等[15]认为雄性大鼠RFRP-3表达水平在5周或6周龄达高峰，在7周龄表达显著下降。而Quennell等[16]认为雄、雌性大鼠发育期(6周龄)到成年期的过程中，RFRP-3的表达水平未下降。小鼠在刚出生时RFRP-3表达水平最高，随后逐渐下降，到了成年期最低；另外，还发现RFRP-3表达可能受血清Leptin的调控[17]。

虽然在雌性啮齿类动物中只有少部分RFRP-3神经元表达雌激素受体(estrogen receptor，ER)，但是目前多项研究普遍认为，RFRP-3表达受到雌激素的调控。雌性叙利亚仓鼠约40% RFRP-3神经元表达ER-α，并且给切除卵巢的仓鼠雌二醇短期治疗(3 h或6 h)后RFRP-3神经元的数量增加[3]。Molnar等[18]在雌性小鼠上发现尽管只有19%的RFRP-3神经元表达雌激素受体(ER-α)，切除卵巢并给予雌二醇治疗4 d后RFRP-3神经元数量减少。这与之前仓鼠上的研究结果不一，可能是物种之间的差异或是实验方法不同等原因造成的，因此还需要进一步的研究证实。关于雄性动物性激素调控RFRP-3的研究数据非常有限，Kirby等[19]认为睾酮不影响雄性叙利亚仓鼠RFRP-3表达。

鸟类中，GnIH的表达受光周期变化的调控。GnIH神经元上可表达褪黑素受体。短日照条件下褪黑素分泌增加GnIH表达量上升，长日照条件下褪黑素分泌减少GnIH表达量降低。哺乳动物RFRP-3神经元上也能够表达褪黑素受体，光周期变化也可通过褪黑素调控RFRP-3表达。处于长日照周期(16L∶8D)的绵羊，其RFRP-3 mRNA的表达量要高于短日照周期(8L∶16D)下的绵羊[10]。Revel等[20]研究发现，叙利亚仓鼠和西伯利亚仓鼠在短日照周期比长日期周期下RFRP-3 mRNA的表达较低。切除松果体的仓鼠给予褪黑素后，能抑制RFRP-3的表达。然而，2009年Paul等[21]研究显示西伯利亚仓鼠在长日照周期下RFRP-3的表达降低，在换到“中间级短日照”后则表达升高，这与先前Revel的研究结果相矛盾。在不同物种中，光周期变化通过褪黑素调控RFRP-3表达的准确作用还需要进一步的研究。

研究还发现压力影响RFRP-3的表达。实验表明RFRP-3神经元可能在压力影响生殖轴过程中起作用。雄性大鼠53% RFRP-3神经元表达糖皮质激素受体，并且急性应激导致RFRP-3免疫阳性神经元数量增多，慢性压力导致RFRP-3基因表达量上升。压力可能通过糖皮质激素调控RFRP-3表达[19]。2015年Geraghty等[22]发现慢性压力下雌性大鼠与正常对照组大鼠相比，RFRP-3表达量增加，不孕率上升，而注射慢病毒载体沉默RFRP-3后，两组不孕率无差别，这说明慢性压力可诱导RFRP-3表达增加，抑制HPG轴，影响生殖功能。同时提示RFRP-3可能是慢性压力导致不孕过程中一个关键靶点。

4RFRP-3在生殖系统中的作用

4.1调控促黄体生成素(luteotropic hormone，LH)分泌及合成目前研究已证实RFRP-3能够抑制下丘脑GnRH进而影响LH合成及分泌。无论是仓鼠、大鼠、小鼠、绵羊，侧脑室或静脉注射RFRP-3均能降低血清LH水平。在体外培养的垂体细胞，RFRP-3也能够降低GnRH刺激导致的LH分泌水平。在研究过程中常切除性腺，以排除性激素负反馈调节对LH水平的影响。卵巢切除的叙利亚仓鼠侧脑室注射RFRP-3 5 min后LH水平明显降低[3]。成年雄性大鼠侧脑室注射10～500 ng不同剂量的RFRP-3，20 min后测LH水平明显降低，且RFRP-3注射剂量越大LH下降越明显[7]。幼年雄性大鼠侧脑室注射RFRP-3反义寡核苷酸沉默RFRP基因表达，血清LH水平上升[23]。2008年Murakami等[14]发现给卵巢切除的成年大鼠静脉注射RFRP-3 2 h后能够降低血清LH的水平。另外，他们发现体外培养的垂体细胞给予RFRP-3后能够降低GnRH刺激导致的LH分泌水平。绵羊上，卵巢切除后静脉注射RFRP-3 1 h后，LH分泌下降，但不影响其他垂体激素水平；同时发现体外培养的绵羊垂体GTH细胞给予RFRP-3不影响LH的基础水平，但是能降低GnRH刺激导致的LH分泌水平，且降低水平与RFRP-3剂量相关[6]。以上研究说明RFRP-3能够抑制成年哺乳动物LH分泌。但是其是在下丘脑GnRH神经元水平还是在垂体水平抑制LH分泌，或是同时作用，目前还不很清楚。大多数研究者认为哺乳动物中的RFRP-3对LH的抑制作用可能主要在下丘脑水平。侧脑室注射RFRP-3能降低GnRH神经元和前腹侧室周核区域神经元的激活。在雌、雄性小鼠电生理学研究发现RFRP-3能够快速抑制43%的GnRH神经元[24]。但是因为很多种类的哺乳动物垂体上可表达GPR147，并且RFRP-3神经元可以投射到正中隆起的神经内分泌区域，所以目前也不能排除RFRP-3对LH分泌的抑制作用发生在垂体水平。

无论在体实验还是离体实验均表明，RFRP-3能影响LH分泌。然而，目前研究认为，RFRP-3对体内卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)分泌无影响，对体外培养的细胞FSH的分泌有影响。雄性大鼠无论是单次侧脑室注射或连续注射RFRP-3 14 d，均只能影响血浆中LH水平，对FSH水平无影响。给卵巢切除的雌性绵羊静脉注射RFRP-3后，血清FSH水平无显著变化，而在体外培养的垂体细胞中，RFRP-3能够降低FSH对GnRH刺激的反应[6]。这可能是因为FSH在体内比LH半衰期更长，对RFRP-3的反应更迟缓。除此之外，还发现注射RFRP-3影响大鼠血清GH水平，但不会影响HPG轴及甲状腺轴[7]。

4.2在性发育启动过程中的作用性发育启动的关键是GnRH脉冲样分泌增加。其调控是一个极其复杂的神经内分泌网络，多种因子可能参与其中。RFRP-3是目前唯一一个对HPG轴起负调控作用的下丘脑神经肽，然而，目前关于RFRP-3在性发育启动过程中作用的研究较少。2008年Johnson等[23]给24日龄雄性大鼠第三脑室注射RFRP-3反义寡核苷酸，抑制RFRP-3表达，发现睾丸增大，LH水平上升，但是并不影响性发育启动时间。2014年巴西的一项研究显示特发性中枢性性早熟患儿(7.4±1.8)岁、孤立性性腺功能减退患者(23.8±7.77)岁的发病与RFRP-3或GPR147基因突变的关系，未发现直接的联系[25]。他们认为RFRP-3在人类性发育启动过程中可能起次要的作用，但是同时表示因为实验的局限性，在这一方面，还需再进行深入研究。2014年Leon等[26]发现NFPP1R(即GPR147)基因敲除小鼠，性发育启动的时间与正常小鼠相比，无明显差异。然而2015年的一项研究发现在雌激素存在的情况下，青春期前小鼠注射RFRP-3能显著降低血清LH水平[27]，又提示RFRP-3可能在青春发育期发挥作用。RFRP-3调控生殖系统的机制复杂，且在不同物种中作用大小有差异，所以还需进一步深入研究。

5结语

RFRP-3已经被证实能够显著抑制哺乳动物LH的合成与分泌，是目前唯一一个能抑制HPG轴的神经肽。RFRP-3可能参与调控哺乳动物生殖、性发育启动等生理过程。它的发现极大地改变了以往对HPG轴调控的认识，为进一步地深入了解生殖系统的各项生理活动提供了崭新的思路。但是RFRP-3参与生殖系统调控的具体作用机制还不清楚，仍有很多重要问题尚待解答，还需要进一步地研究。

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(本文编辑：刘颖)

Research progress of regulatory effects of RFRP-3/GPR147 signaling pathway on mammalian reproductive system

HANXinghui，YUJian.

DepartmentofIntegrativeMedicine，Children'sHospitalofFudanUniversity，Shanghai201102，China.

【Abstract】The function of mammalian reproductive system，a complex biological process involving multiple regulators, depends on the regulation of hypothalamic-pituitary-gonad axis. At present, RFRP-3 is the only one inhibitor of HPG axis known at the hypothalamic level in mammals. In recent years, a large number of studies have found that RFRP-3 can inhibit GnRH and LH release in mammals by combining into the G protein coupled receptor 147(GPR147) and affect the function of reproductive system. In this review, the authors summarize the significant research advances in RFRP/GPR147 signaling pathway in mammalian species in the recent ten years. In addition, the regulatory mechanism of RFRP-3 in HPG axis and role of RFRP-3 in modulating mammalian reproductive system are systematically elaborated.

【Keywords】Puberty onset;RFRP-3；GnRH；LH；Reproductive system

作者简介：韩兴绘(1989-)，女，复旦大学2013级硕士研究生在读。研究方向：中西医结合治疗儿科疾病及相关机制研究 通讯作者：俞建，E-mail：yuj@shmu.edu.cn

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.03.002

【中图分类号】R725

【文献标识码】A

【文章编号】1674-3865(2016)03-0253-05

(收稿日期：2016-05-06)