荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用

胡春梅 郭晶 严虹 施旭东 张侠



·论著·

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用

胡春梅 郭晶 严虹 施旭东 张侠

目的 应用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测耐多药结核病患者的临床分离菌株对一线抗结核药物的耐药基因突变。方法 于2009年1月1日至2012年12月31日留取南京市胸科医院结核科门诊部或住院的所有肺结核患者痰液标本，每人3～5 ml，均进行痰结核分枝杆菌培养、鉴定和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，分离出结核分枝杆菌菌株67株。应用荧光定量PCR探针熔解曲线法，根据靶序列熔点变化，实时PCR检测结核病患者的临床分离标本对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药情况；通过与传统药敏试验进行对比，对2种结果不一致的菌株进行基因测序分析，探讨其发生突变的位点差异，并观察在治疗中的变化。结果 利福平和异烟肼的表型和基因型检测具有较高的一致性，分别为99%(66/67)和97%(65/67)，不一致的菌株都是表型检测法为耐药，而基因型检测为敏感，测序未检测到突变。乙胺丁醇和链霉素的表型和基因型检测一致性较低，分别为60%(40/67)和75%(50/67)。测序发现，乙胺丁醇的突变发生在embB306和embB406位点上；链霉素突变发生在rrs基因517位点和907位点，以及rpsL43耐药密码子。结论 应用荧光定量PCR探针熔解曲线法，能快速筛查结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药情况。

探针熔解曲线法； 结核，肺； 抗药性，多种，细菌； 耐药基因； 突变

耐多药结核病是结核病治疗中的重点和难点，开展结核分枝杆菌耐药性的动态监测，是结核病控制工作的一项重要内容，也是制订抗结核化疗方案的重要依据。笔者曾对耐多药肺结核患者在治疗中的不同时间点，动态监测其结核分枝杆菌的耐药性，发现有获得耐药性及恢复敏感性的现象发生，其中异烟肼和利福平表现为高度耐药性且稳定，乙胺丁醇和左氧氟沙星表现为高获得性耐药[1-2]。结核分枝杆菌痰培养和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，是目前检测结核分枝杆菌耐药的金标准，但由于结核分枝杆菌生长缓慢，很难达到快速检测的要求，具有一定局限性[3]。基因型耐药检测，通过检测结核分枝杆菌特定基因组区域的突变来预测耐药，因其耗时短，能较快地指导临床用药，逐渐成为结核分枝杆菌耐药快速检测的趋势[4]。但有文献报道，在临床应用中基因型耐药检测与表型耐药检测存在不一致[5-6]。因此，本研究设想应用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测耐多药结核病患者的临床分离菌株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的耐药基因突变，并与传统药敏试验法进行对比，衡量基因型检测的一致性；对不一致性的菌株进行基因测序，探寻是否有新的突变位点，观察耐多药肺结核患者的耐多药菌株在抗结核治疗过程中，对一线抗结核药物表型和基因型耐药性的动态变化，为耐多药肺结核治疗方案的调整提供参考。

材料和方法

一、菌株来源

于2009年1月1日至2012年12月31日，留取南京市胸科医院结核科门诊部或住院的所有肺结核患者的痰液标本3～5 ml，均进行痰结核分枝杆菌培养、鉴定和药敏试验。

野生型菌株为国家结核病参比实验室提供的结核分枝杆菌H37Rv标准株。

二、 方法

1.痰结核分枝杆菌培养和菌种鉴定及药敏试验：按WHO和全国结核分枝杆菌药敏试验标准化操作程序及质量保证要求[8-11]，进行痰结核分枝杆菌培养和菌种鉴定，证实为结核分枝杆菌。用绝对浓度法[9]进行4种一线抗结核药物耐药性的检测。各药物均设高低2个浓度，试验浓度分别为：Sm(10，100) μg/ml，INH(1，10) μg/ml，EMB (5，50) μg/ml，RFP(25，250) μg/ml。以对照管生长，含药高、低浓度管均不生长为敏感；含药低浓度管生长、高浓度管不生长为中度耐药；含药高、低浓度管均生长为高度耐药。本研究所指的耐药包括中度耐药和高度耐药。其中用H37Rv标准株进行常规质量控制，同时运用比例法与绝对浓度法进行对比试验，以此对绝对浓度法进行质量控制。

2.耐多药结核分枝杆菌对一线抗结核药物耐药相关基因突变的检测：对67株待检测的耐多药结核分枝杆菌菌株进行复活、接种、灭活，采用煮沸法提取结核分枝杆菌基因组DNA(经紫外定量，要求结核分枝杆菌含量不低于103拷贝/μl)进行加样。同时设立阴性(无菌双蒸水)和阳性对照品(H37Rv菌株)DNA各5 μl，用CFX96实时荧光PCR扩增仪(美国，伯乐公司)进行扩增。应用荧光定量PCR探针熔解曲线法(耐药突变检测试剂盒，厦门致善生物科技有限公司)检测结核分枝杆菌菌株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素的突变，进行耐药筛选，用于获得结核分枝杆菌对4种药的耐药信息。其中，利福平检测结核分枝杆菌复合群rpoB基因507～533共27个氨基酸密码子区域内(81 bp，利福平耐药决定区)的突变。异烟肼检测ahpC启动子区(-44～-30以及 -15～3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17～-8位点)及katG315密码子的突变，具体可检测的耐药突变位点包括ahpC启动子 -44A、-42C、-39T、-34C、-32A、-30T、-15T、-12T、-10A、-10G、-10T、-9A、-6A、-4G，ahpC4T，inhA94GCG，inhA启动子 -17T、-16G、-15T、-11T、-8A、-8C，katG315AGG、katG315CGC、katG315CTC、katG315ACC、katG315AAC、katG315ATC、katG315ACA。乙胺丁醇检测embB306、embB497、embB368、embB378、embB380和embB406位密码子是否突变。链霉素检测结核分枝杆菌rpsL基因43位密码子和88位密码子，以及rrs基因513～517位点和905～908位点的突变。

采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析敏感度，然后用标准盘验证其检测特异度。对熔解曲线法与传统药敏试验检测结果不一致的样本进行测序。

三、统计学分析

本试验用Chromas 2软件分析测序结果，用Clustalx软件比对是否突变，将整理后的突变数据和耐多药结核分枝杆菌菌株药敏试验数据导入SPSS 13.0软件进行统计分析，同一菌株的突变数据和耐药数据相互对应。

结 果

一、菌株的提取

参照中国防痨协会[7]《耐药结核病化学治疗指南》，制定抗结核治疗方案为6 Am(Cm)、Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z/18Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z，治疗共24个月，每3个月进行1次痰结核分枝杆菌培养。统计治疗期间痰结核分枝杆菌培养阳性2次以上(包括治疗前)的耐多药肺结核患者，共14例。其中男7例，女7例，年龄(35.0±9.0)岁，共获得结核分枝杆菌菌株67株，-70 ℃冷冻保存在南京市胸科医院中心实验室菌株库，进行治疗前后4种常用抗结核药物表型和基因型耐药检测的对比分析。

二、耐药表型及基因型检测的一致性

结核分枝杆菌菌株对4种抗结核药物耐药的表型及基因型检测的一致性分别为：利福平99%(66/67)、异烟肼97%(65/67)、乙胺丁醇60%(40/67)、链霉素75%(50/67)。

三、耐药表型及基因型检测不一致的菌株分析

用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药，与药敏试验法结果不一致的菌株分别仅为1株、2株，都是表型检测法为耐药，而基因型检测为敏感。对不一致菌株进行了测序，未检测到突变。对乙胺丁醇耐药检测，2种方法不一致的菌株为27株，其中乙胺丁醇表型检测法为耐药，而基因型检测为敏感有14株，对14株测序，相应检测位点峰型为单峰，未检测到突变。对乙胺丁醇表型检测敏感但基因型检测耐药的有13株，有10株样本的突变发生在embB306位点上，其中有7株出现ATG→GTG突变，1株为ATG→CTG突变，1株为ATG→ATT突变，1株为ATG→ATA突变；有3株样本的突变发生在embB406位点上，出现GGC→GCC突变。对链霉素耐药检测，2种方法不一致的菌株有17株菌株。其中6株表型检测法结果为耐药，而基因型检测法结果为敏感，测序未检测到突变；而11株表型检测法为敏感，而基因型检测法结果为耐药，对其测序发现，有9株发生rrs基因517位点的C→T突变，1株发生rrs基因907位点的A→T突变，1株发生rpsL43耐药密码子的AAG→AGG突变。

四、菌株耐药的动态变化

14例耐多药结核病患者的67株菌株对利福平、异烟肼表型耐药稳定，没有动态改变，呈持续耐药；基因型耐药检测显示也相对稳定，仅有1例患者的结核分枝杆菌菌株发生动态变化，该例患者的结核分枝杆菌菌株在治疗前基因型检测是耐药，而治疗后基因型检测是1株对利福平、2株对异烟肼敏感但无突变。然而对乙胺丁醇、链霉素的表型和基因型耐药检测提示均不稳定，其耐药性可能会发生改变。其中乙胺丁醇表型检测显示：1例患者出现复敏，1例出现继发耐药，1例出现复敏后再次继发耐药；基因型检测有1例发生动态变化，从耐药基因有突变到无突变又再次突变。链霉素的表型耐药检测2例出现继发耐药，1例出现复敏；基因型检测发现有3例发生动态变化，其中2例耐药基因从无突变到突变。

五、菌株发生耐药动态变化的临床病例分析

在治疗过程中，14例耐多药结核病患者的耐药基因发生动态变化，主要集中在3例患者的38株。临床共同特点是：复治多年、肺部病灶广泛(病灶范围≥3个肺叶)、伴有1个以上空洞或肺叶毁损。临床治疗方案是：对氨基水杨酸异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星或莫西沙星、阿米卡星静脉滴注6个月。

讨 论

随着分子生物学技术的发展，发现造成结核分枝杆菌耐药的分子机制与基因突变有关。不同的基因突变使感染人体的结核分枝杆菌产生不同的药物耐受性。实时荧光PCR技术将扩增和检测两步骤合一，具有实时扩增实时检测、高效、快捷、简便、经济等优点，可以同时对结核分枝杆菌耐药多个相关基因突变同时进行检测，特别适用于大批量筛查[12-15]。

因此，笔者应用荧光定量PCR探针熔解曲线法，根据靶序列熔点变化，实时PCR检测结核分枝杆菌基因组中的耐药相关突变位点变化，以分析耐药情况。对67株耐药结核分枝杆菌菌株进行4种一线抗结核药物耐药基因型检测，和传统的表型检测金标准相比较，结果表明利福平和异烟肼的表型和基因型检测具有较高的一致性，分别达99%和97%，而乙胺丁醇和链霉素的表型和基因型检测一致性相对偏低。对2种检测方法不一致的菌株进行乙胺丁醇和链霉素的基因测序，进一步探索其他基因或基因区引起的突变，发现对药敏试验结果为耐药但用荧光定量PCR探针熔解曲线法结果为敏感的菌株进行基因测序，未检测到基因突变；对药敏试验结果为敏感但用荧光定量PCR探针熔解曲线法结果为耐药的菌株进行基因测序，乙胺丁醇存在embB306、406基因位点突变，链霉素存在rrs基因517、907位点和rpsL43耐药密码子的点突变，这些突变位点均是既往已经报道过的[16-17]，没有发现新的基因突变位点。

分析2种检测方法不一致的原因可能如下：(1)耐多药结核分枝杆菌菌株对乙胺丁醇和链霉素的表型耐药动态监测发现：存在不稳定性，可能会发生动态变化[1-2]。(2)表型检测试验结果虽然是当前检测耐药的金标准，但仍存在局限性；(3)本试验的耐药突变检测，只筛选核酸序列而不是氨基酸序列。因此，有可能不引起氨基酸改变的突变(沉默突变)也会被判为突变型。(4)如检测样品出现不均一耐药菌株，耐药菌株的比例偏低，需要结合熔解曲线峰型具体判断突变比例，有可能出现假阴性，而判定为敏感无突变。(5)可能是与新的耐药机制有关，如已知耐药基因以外的其他基因突变和外排泵机制等，也可能存在异质性耐药或外源性再感染、混合感染以及药敏试验结果误差等[5-6,18]，仍需要扩大基因库及进一步研究。

另外，对耐多药结核分枝杆菌菌株在治疗过程中对4种抗结核药物的耐药性的动态变化分析发现，不管用表型还是基因型检测，利福平和异烟肼的耐药性都很少发生改变；但是乙胺丁醇和链霉素均显示相对不稳定，说明在治疗过程中对乙胺丁醇和链霉素的耐药性可能会发生改变。因此，在临床治疗过程中，笔者建议要对乙胺丁醇和链霉素进行动态的耐药检测，以便及时调整治疗方案。

总之，本研究用荧光定量PCR探针熔解曲线法，实时检测结核分枝杆菌基因组中的耐一线抗结核药相关突变位点变化，以判断是否耐药；并和传统的药敏试验结果检测进行对比，发现结核分枝杆菌菌株对利福平、异烟肼的基因检测与药敏试验结果、测序结果具有较高的一致性。对不一致的菌株再次进行基因测序，结果发现用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测为敏感的菌株未检测到基因突变；而用荧光定量PCR探针熔解曲线法检测为耐药的菌株确实存在基因位点突变，但突变位点均是已经报道过的，在待检的菌株中没有发现新的基因突变位点。耐药基因检测的优势在于快速了解耐药基因位点突变，筛查耐多药肺结核，并在治疗中进行动态监测，及时了解患者耐药信息和突变位点的变化，精确寻找到耐药的原因并指导调整有效的治疗方案，为精准个体化医疗奠定基础，有利于结核病的控制和阻断耐药结核分枝杆菌的传播，具有较大的社会经济效益，值得临床推广。然而，本研究只检测了67份药敏试验结果证实的耐多药结核分枝杆菌菌株标本，样本量偏少，且没有检测敏感结核分枝杆菌菌株、明确有无外源性再感染、混合感染或异质性耐药等，还存在一定局限性。

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(本文编辑：王然 李敬文)

Fluorescence quantitative PCR probe melting curve method in detection of drug resistance genes in

MycobacteriumtuberculosisHUChun-mei,GUOJing,YANHong,SHIXu-dong,ZHANGXia.

DepartmentofTuberculosis,NanjingChestHospital,Jiangsu，Nanjing210029，China

s:ZHANGXia,Email:zhangxia365@sina.com

Objective By fluorescence quantitative PCR probe melting curve method, to detect the resistance mutations of multidrug-resistant tuberculosis clinical isolates to first-line anti-tuberculosis drug, and to provide re-ference for multidrug-resistant tuberculosis treatment. Methods Collecting sputum of all TB patients visiting Nanjing chest hospital between January 1, 2009 and December 31, 2012, 3-5 ml per person, did culture and identification ofMycobacteriumtuberculosisand drug sensitivity test. Sixty seven strains ofMycobacteriumtuberculosiswere isolated. According to the target sequence changes in melting point, to test Rifampicin, Isoniazid, Ethambutol, and Streptomycin resistance by fluorescence quantitative PCR probe melting curve method. By comparison with the conventional susceptibility testing, to analyze the inconsistency of strain genome sequencing of 2 kinds of methods and explore the site differences in mutation, and observe the changes in treatment. Results The phenotypic and genotypic characteristics of the strains resisting to Rifampicin and Isoniazid had a high consistency, which was 99% (66/67) and 97% (65/67), respectively. Testing different strains were phenotypic resistance but genotypic sensitive, which was not detected by sequencing mutation. However, the consistency between the phenotype and genotype of anti-ethambutol and streptomycin strains was 60% (40/67) and 75% (50/67), respectively. Sequencing found Ethambutol mutation occurred in theembB306 andembB406 sites. Streptomycin gene mutations occurred inrrs517,rrs907 andrpsL43. Conclusion The application of the fluorescence quantitative PCR probe melting curve can rapidly screenMycobacteriumtuberculosisdrug resistance to first-line anti-tuberculosis drugs.

Probe melting curve method； Tuberculosis, pulmonary; Drug resistance, multiple, bacterial; Genetic mutations; Genotype analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.01.009

南京市医学科技发展重点项目(ZKX12035)

210029 江苏省南京市胸科医院结核科(胡春梅、郭晶、张侠)，检验科(严虹、施旭东)

张侠，Email：zhangxia365@sina.com

2015-06-15)