深静脉血栓形成诊断研究进展

邓华亚 徐新 张社兵

深静脉血栓形成诊断研究进展

邓华亚 徐新 张社兵

深静脉血栓形成；诊断；纤溶酶原激活物抑制剂-1；微小RNA

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是临床上的常见病、多发病，是血液在深静脉内不正常凝结引起的静脉回流障碍性疾病，多发生在下肢。其发病率占周围血管疾病的40%，流行病学调查表明，人群年发病率为0.10%～0.18%。有研究表明，在美国DVT已成为第3位常见的心血管疾病及第1位的外周血管疾病[1]，而在中国尚缺乏确切的DVT流行病学资料。DVT可致使患肢肿胀、疼痛，影响肢体活动，如果诊断和处理不及时，血栓脱落可导致肺动脉栓塞（pulmonary embolism，PE），严重时可危及生命，两者合称为静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE）。远期可继发深静脉血栓后综合征（post-thrombotic syndrome，PTS），患肢可出现肿胀、静脉曲张、色素沉着、溃疡、湿疹等，PTS的发生率在20%～50%[2]。深静脉血栓形成的复发问题也不容忽视。有资料表明，无促因的静脉栓塞性疾病1年后复发率为11%，10年后为40%左右[3]。加之人们意识不足，诊断落后，抗凝治疗周期长且不确定性，INR值监测频繁，患者依从性欠佳，此病可严重影响患者的生活质量和工作能力。因此，深入认识DVT发生机制、提高预防和诊断水平、优化临床治疗方案极具现实意义。

1 深静脉血栓形成的病因及危险因素

现今已知，深静脉血栓形成病因是1856年德国病理学家Rudolph Virchow提出的3大基本因素，即静脉壁损伤、血流缓慢及血液的高凝状态。正常的血管内壁有内皮细胞，内皮细胞具有抗血栓功能。血液有凝血和抗凝系统，以及纤维蛋白溶解系统和抗纤维蛋白溶解系统，血流状态和速度也对血栓发生有一定影响。在正常情况下，这三种因素保持平衡，因此不易发生血栓。当它们受到复杂的多基因遗传性及环境获得性因素影响，血液凝血-抗凝及纤溶-抗纤溶平衡的因素受到破坏，均可导致血栓性疾病的发生。家系分析及孪生子研究表明[4]，静脉血栓形成约有近60%由遗传因素控制；遗传因素决定了不同个体对血栓形成有着不同的易感性，而这种易感性是伴随终身的，在一种或多种获得性因素的诱导下容易导致血栓形成。而继发的获得性环境相关因素包括手术与制动、妊娠、产后、吸烟、肿瘤、肥胖、高龄、长期卧床、长期留置中心静脉导管、重症感染、损伤、骨折等[5,6]。病因虽已众所周知，然而其确切发病机制尚不清楚。

2 深静脉血栓形成的物理诊断方法

DVT诊断方法多样，各项检查方法各有利弊。静脉造影：准确性高，可作为诊断DVT的金标准，但限于技术等原因多不能及时检查，有发生过敏及血栓风险，并有一定创伤，另约有20%的患者显影不好而导致近端的血栓常不能得出正确的诊断。磁共振静脉成像：非创伤性检查，能准确显示髂、股、腘静脉血栓，但不能满意地显示小腿静脉血栓，且费用昂贵。超声检查：无创伤性，为目前临床DVT诊断的首选方法，对于近端DVT的诊断敏感度和特异度为97%，但对于有症状的小腿DVT的诊断敏感度为75%，对诊断小腿肌间静脉血栓不敏感，常需重复检查。近期Guerrero等[7]的研究表明，基于传感器的B超压力、血流多点联合监测系统可使DVT敏感度及特异度提高至百分百，此系统及技术的推广、应用值得期待。

3 深静脉血栓形成血浆分子标志物的研究

目前对于DVT的研究已进入分子水平。在血栓的形成过程中，涉及血管内皮功能紊乱、血小板活化及聚集、凝血因子激活、纤溶系统异常等一系列复杂酶促反应，有多种凝血因子、细胞因子、黏附分子、蛋白酶等参与其中，选择有效敏感、特异的血浆分子标志物以早期诊断是目前临床研究热点之一。其中包括：①血管内皮受损后血浆或内皮细胞表面凝血酶调节蛋白、内皮素升高，表明高凝状态和血栓形成。②血小板激活后标志物测定血栓形成有血小板参与，如纤维蛋白原（Fg）浓度增高与静脉血栓形成有关，它是各种血栓形成必须参与的重要物质，同时也是一种大分子量的球蛋白，其含量升高可增加血液黏稠度，也有利于静脉血栓形成。但其并不是血栓形成的真正病因，通过何种机制影响DVT形成有待进一步研究。③反映纤溶系统的指标主要包括D-二聚体、血液循环中组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，t-PA）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1） 测定，α2-纤溶酶抑制剂测定，纤溶酶原及纤溶酶活性测定等。研究表明，血栓前状态中还有血栓素B2（TXB2）、a颗粒膜蛋白（GMP-140）上升，6-酮前列腺素 F1a（6-ketoPG1a）降低等[8]。Rosendaal[9]的研究认为，因其多因素作用特点，临床上仅用单一的血栓标志物进行诊断存在困难。Ramacciotti等[10]探索运用蛋白质组学技术检测多个敏感、特异的血浆分子标志物的组合，并建立DVT诊断模型，有助于血栓栓塞性疾病的早期诊断。

3.1 D-二聚体检测在深静脉血栓形成中的临床应用 D-二聚体是已广泛应用于临床血栓性疾病诊断、疗效评估、预后判断的指标，它是最简单的纤维蛋白降解产物，质量浓度的增加可反映体内存在高凝状态及继发性纤溶亢进[11]。其诊断静脉栓塞性疾病的灵敏度高达92%～100%，但其特异度低，仅为40%～43%，严重感染、恶性肿瘤、创伤、高龄等均可使D-二聚体升高[12]。有学者如Sartori等[13]提出，利用临床预测法则（Wells score）联合D-二聚体检验可以提高DVT诊断特异度。但Silveira等[14]进行的一项前瞻性队列研究表明，Wells评分用于门诊筛查尚可，而对于住院患者仅起到风险识别作用，因其准确判别率低至60%，不足以完全排除DVT和影响住院患者的管理及治疗决策。另有国内外多项研究提示，血浆D-二聚体水平在抗凝治疗的早期或溶栓开始后先上升，后逐渐下降，表明D-二聚体在疗效监测及指导抗凝治疗个体化方面可能具有重要的临床意义[15,16]。

3.2 T-PA和PAI-1与深静脉血栓形成的关系 纤溶系统异常在深静脉血栓形成过程中占有重要作用，而t-PA及PAI-1在维持其纤溶与抗纤溶系统平衡中发挥重要作用。T-PA是血液中主要的内源性纤溶酶原激活物，在纤维蛋白存在的情况下，激活纤溶酶原转变成纤溶酶，纤溶酶则降解纤维蛋白，从而溶解血栓，因此重组人组织型纤溶酶原激活剂已在临床上广泛用作血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物。T-PA的活性可被血浆中纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）和α2-纤溶酶抑制剂纤溶酶抑制物等抑制。纤溶酶原激活剂抑制物（PAI）约占纤溶系统抑制物活性的60%。PAI-1是其中最重要的成分，是t-PA的主要抑制物。两者之间存在着平衡，维持着血液流动状态。研究表明，PAI-1对这一平衡起决定作用[17]。既往针对t-PA及PAI-1与DVT关系的研究表明，其发病可能由于t-PA产生和释放不足或活性降低造成；或是PAI-1产生和释放过多使PAI-1活性增强所致。一些研究测定了DVT患者的纤溶功能、t-PA抗原和PAI-1抗原水平，结果显示，有DVT病史者PAI-1的基因表达显著增强。PAI-1（-675I/D、4G/5G）基因多态性可通过影响核蛋白类的结合参与到PAI-1基因的转录中来[4]。其中4G/4G基因型及4G等位基因的频率分布，深静脉血栓形成组要显著高于对照组，提示该基因可能通过影响体内纤溶活性及纤维蛋白原的水平从而影响深静脉血栓形成的发病[18,19]。进一步研究发现，体内PAI-1水平还受多种因素调控，其中微 RNA（microRNAs，miRNAs）即是近年发现的很重要的一种调节因子。

3.3 MiRNAs与深静脉血栓形成的研究 MiRNAs是一类长度为21～22个核苷酸（少数＜20个核苷酸）的内源性非编码小RNA，由1993年Lee等[20]在对秀丽新小杆线虫的研究中首次发现。随后大量的实验证明，循环miRNAs可以广泛而稳定地存在于人类细胞外液，包括血清、血浆和各种组织细胞中，证实这是一类在进化过程中高度保守的RNA。大量证据表明，miRNAs是人体正常器官、组织发育所必需的，它可调节1/3左右的人类基因，参与诸如免疫、炎症等病理生理过程[21]。已有许多研究表明，机体发生不同疾病时，miRNAs随之有着相应改变，因此，miRNAs可能作为一种新的疾病诊断标志物应用于临床[22,23]。MiRNAs作为调节分子家族的一员，有希望在未来心血管、恶性肿瘤、炎症等疾病的新型诊断生物标志物中占有一席之地。

研究发现[24]，miRNA-146a表达下调可使PAI-1、IRAK1、IL6、IL8等细胞因子表达增多。Wik 等[25]的研究表明，IL-6、高敏C反应蛋白等炎症指标明显升高与妊娠相关的DVT继发PTS显著相关，提示miRNA-146a可能在深静脉血栓形成及其远期并发症发生过程中发挥调控作用。

近年Starikova等[26]进行了一项以评估静脉栓塞性疾病患者血浆miRNA表达水平及评价miRNA作为潜在生物标记物可能性为目的的小规模病例对照研究，结果表明，血浆miRNA在静脉栓塞性疾病患者及健康对照者中表达不同；循环系统中的miRNA可能成为静脉栓塞性疾病潜在的生物标记物。在深静脉血栓形成病例中检测到近97种miRNA，其中相对于健康对照组表达上调的有miR-10b-5p、-320a、-320b、-424-5p、-423-5p 等；表达下调的有 miR-103a-3p、-191-5p、-301a-3p、-199b-3等，其具体作用靶点需做进一步探讨。另有研究[27]表明，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在血栓患者中起到血管再通及重塑的重要作用。Kong等[28,29]近期研究通过分离DVT患者及对照组的EPCs，检测其miRNA的表达谱并筛选出差异基因miRNA，结果表明，miR-483-3p的上调及let-7e-5p的下调各自通过影响血清反应因子（serum response factor，SRF）、Fas 配体（Fas ligand，FASLG）而引起EPCs功能紊乱并促进其凋亡，可望成为未来诊断及治疗的新靶点。

4 总结与展望

综上所述，深静脉血栓形成是一种遗传性及获得性的复杂疾病，涉及凝血、抗凝、纤溶、血管损伤、血液流变等多因素作用。其发病机制及诊断治疗仍有进一步研究空间，单凭临床症状评估做出深静脉血栓形成（DVT）的诊断并不可靠，万一误诊会带来不必要的抗栓治疗及出血风险，故辅助检查显得尤为重要。DVT初诊的最佳策略需结合其验前概率评分、D-二聚体及血管加压B超等手段联合应用，而对于复发性DVT、上肢DVT、妊娠期间DVT的诊断目前仅有相对较低级别的证据支持[30]。生物标记物的研究已进入分子水平，在对其发病机制中重要的一环——纤溶-抗纤溶系统的研究中发现，PAI-1增多对血栓形成具有重要作用，而miRNA可能起到重要调控作用。但具体机制尚不明确，蛋白质组学、基因学等分子领域的研究可望取得进展。

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Advances of diagnosis in deep vein thrombosis

Deep vein thrombosis；Diagnosis；Plasminogen activator inhibitor-1；MiRNAs

韶关市卫生和计划生育局科研项目（项目编号：Y15017）；韶关市科技计划（医学类）项目（项目编号：2015CX/K001）

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徐新，E-mail：03xuxin@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.002

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1672-5301（2016）08-0678-04

2016-02-24）