神经型一氧化氮合酶在心功能及其病理生理过程中发挥作用的分子机制

刘文博 崔兰 赵光贤 金春子

综述

神经型一氧化氮合酶在心功能及其病理生理过程中发挥作用的分子机制

刘文博 崔兰 赵光贤 金春子

神经型一氧化氮合酶；一氧化氮；心功能；信号转导通路

20世纪70年代末期，一氧化氮（Nitric oxide，NO）被认定为一种涉及广泛生物学功能的信号分子[1-3]。这一发现使 Robert F.Furchgott、Louis J.Ignarro和FeridMurad在1998年获得了诺贝尔生理学或医学奖。现在已经证实，产生NO的酶，即一氧化氮合酶（NOS）包括三种亚型：神经型一氧化氮合酶（nNOS或NOS1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS或NOS3）。一直以来，eNOS被认定是在心肌中NOS的唯一亚型。它在心脏中的多种功能调控也得到了证实[4,5]。1999年，Xu等人报道心肌肌质网（sarcoplasmic reticulum，SR）中表达nNOS。这种被表达的nNOS能够控制肌质网钙泵（SERCA）而调节细胞内Ca2+的重吸收。nNOS也在心肌内神经元的自主神经和神经节中表达[6-8]，并通过交感和副交感神经调节心律和心收缩力。此外，nNOS还能在人类冠状动脉平滑肌细胞[9]中表达和维持基础血流量[10]。总之，这些研究结果证实，nNOS在心脏中的作用是能够在心脏内所有至关重要的部分中表达，并在调节心律、心肌收缩力和微循环中起着重要的作用。

nNOS与eNOS在结构和NO的产生上有相似之处。激活的nNOS是由一个N端含有氧化酶结构域和C端含有还原酶结构域的同源二聚体构成的。在心肌细胞中，nNOS与eNOS在受到刺激后，存在部位和转运、转录后修饰，以及在心血管系统中介导发挥病理生理学功能的机制均有所不同[5,11-14]。例如，eNOS主要位于细胞膜的caveolae中[15]，并介导细胞内Ca2+从ryanodine受体（RyR）中释放[16]。nNOS位于心肌肌质网[17,18]和细胞膜[19]中，并调节心肌细胞中Na+和Ca2+的平衡。由nNOS产生的NO能调节心肌细胞的收缩并通过作用于兴奋-收缩耦联的关键部位［例如受磷蛋白（PLN）或L型钙通道（LTCC）］来促进心肌舒张。这时NO的半衰期很短（大约10 s）并且扩散区域有限，因此，nNOS或者移位到附近靶蛋白的nNOS发挥足够的影响是必要的。本质上讲，nNOS和它的动态移位的空间限制，保证它能在正常和异常心脏中调节多种信号传导通路和心肌功能。

1 nNOS调节心脏功能的作用机制

1.1 正常心脏中的nNOS 通过使用nNOS基因敲除和心肌细胞特异性nNOS表达模型与nNOS抑制剂的结合（比如SMTC、L-VNIO或7-NI），现已证实，基础剂量的nNOS产生的NO对正常和异常心脏的收缩和舒张起着调节作用。在正常的心脏中，由nNOS产生的NO通过S-亚硝基化或者cGMP依赖机制，调节细胞膜中LTCC的活性，以减少细胞内大量的一过性Ca2+内流[20]，从而弱化心肌基础收缩力。相比之下，心肌内的Na+-Ca2+交换则不受影响[20]。在肌质网中，nNOS源性NO促进心肌舒张，通过增加PKA-依赖（而不是cGMP/PKA依赖）PLN磷酸化位点16丝氨酸的磷酸化和Ca2+/钙调蛋白依赖激酶Ⅱ（CaMKⅡ）-依赖的PLN磷酸化位点17苏氨酸磷酸化来促进SERCA对细胞内Ca2+的重吸收，继而抑制蛋白磷酸酶A2（PP2A）和蛋白磷酸酶1（PP1）的活性[21]。nNOS源性NO可能通过S-亚硝基化直接激活SERCA，或通过过氧亚硝基-依赖的S-谷胱甘肽化间接激活SERCA[22]。nNOS源性NO对RyR活性的影响是有争议的，因为nNOS的基因缺失同RyR leak的增加[23]和RyR开放概率的减小[24]有关。此外，通过由α-syntrophin蛋白（SNTA1）联合细胞膜钙泵（PMCA4b）和心脏Na+通道（SCN5A），nNOS产生一个大复合体，并能被 PMCA4b紧张性抑制。nNOS同 PMCA4b在SNTA1的变异中分离，并刺激失活的nNOS进而增加S-亚硝基化的SCN5A和晚期Na+电流。因此nNOS与SCN5A-依赖型长QT间期综合征有关[19]。越来越多的证据证明，nNOS源性NO通过靶蛋白而非钙处理原理来调节心功能。例如，我们的前期工作和其他组的研究结果表明，nNOS控制心脏的氧化酶活性，如黄嘌呤氧化还原酶[25]和NADPH氧化酶[26]，并减轻细胞内超氧化物和活性氧（ROS）的水平。作为活性氧（如过氧化氢）和反应性含氮物质（RNS，如过氧亚硝酸盐）的靶蛋白激酶/磷酸酶[27]，nNOS对离子通道活性和细胞内钙处理蛋白的调节可能是通过大量的转录后修饰，如NO-依赖的S-亚硝基化，ROS-依赖的氧化和激酶/磷酸酶依赖的磷酸化来介导的。本质上讲，nNOS源性NO的靶蛋白种类决定了下游的转录后修饰。此外，nNOS可能通过调节线粒体的蛋白来影响心肌的功能。已有研究指出，nNOS源性NO能抑制线粒体中的呼吸链，包括复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ[28,29]，并减少线粒体的氧耗，影响心脏的代谢。这种调节对正常或异常心肌功能有害还是有利，还有待确定。总之，目前的证据表明，nNOS源性NO通过针对心肌细胞多种细胞器中蛋白的调控来影响心脏功能。

1.2 异常心脏中的nNOS 重要的是，在有心脏疾病如缺血再灌注损伤[30]、梗死[18,31]、肥大和心衰[32]的时候，心肌细胞内的nNOS蛋白表达及活性均有所增高，并能在多方面发挥有利影响。nNOS源性NO保护心肌舒张功能，并增加β-肾上腺素的储存，减轻左室肥大/扩张/梗死范围，使心肌免受心律失常的损害。最近的研究证实了nNOS的上调是伴随致病性损害和疾病发展过程中的一种早期事件。我们发现，在体外对单纯左室在短时间内进行血管紧张素Ⅱ处理后，显著增加了mRNA/蛋白质表达和nNOS的活性[26]。继而，nNOS源性NO减少超氧化物产生NADPH氧化酶，并通过cGMP/PKG-依赖（和PKA-依赖）PLN-Ser16的磷酸化来促进左室舒张。类似的，在由血管紧张素Ⅱ诱发的患高血压大鼠的左心室肌细胞中，nNOS蛋白表达和活性得到了增高（这是由于体内灌注4周血管紧张素Ⅱ并不能引起心室肥大，且不能通过超声心动图检测出心肌舒缩功能的异常）。nNOS不能改变心肌收缩力或LTCC的活性，但能够通过cGMP/PKG-依赖的磷酸化TnI-Ser23/24和cMyBP-C-Ser273，进而通过肌丝钙敏感性来促进左室舒张[33]。有趣的是，在患高血压大鼠的左室细胞中，PLN-Ser16有所增加，并且Ca2+的瞬变减少（通过SERCA重吸收Ca2+）也变得更快。这些改变并不是依赖于nNOS或者cGMP/PKG-依赖的信号传导方式。在有些研究中，对大鼠心肌灌注血管紧张素Ⅱ，3 d和6 d后，nNOS蛋白表达得到了增强[34,35]。这些结论证实了nNOS的上调在疾病发展中是一个早期事件，并且nNOS在应激条件下对心脏起保护作用。此外，在大鼠患高血压前期（青年自发性高血压），星状神经节细胞中nNOS的蛋白表达和活性有所减少，细胞内的［Ca2+］i有所增多。相反，nNOS通过一个异常去甲肾上腺素激活的细胞特异性的载体传递到交感神经元，以降低［Ca2+］i[36]。nNOS 作为调节交感神经传递的重要方式[37]，这些结果表明，在高血压早期自主神经系统和收缩心肌中的nNOS可能协同促进心脏保护效应。在人类扩张性心肌病和鼠类心肌梗死心肌中，nNOS的上调与RyR相互作用的减少和与Cav3在心肌细胞质膜结合的增多有关[18,38]。这种定位可能增加其在细胞膜对Ca2+流量的控制或者抑制NADPH氧化酶。的确，nNOS与Cav3的联合随着缺血再灌注损伤和nNOS减弱ICa的β肾上腺素兴奋（通过增加S-亚硝基化的LTCC）而增强。nNOS还能减弱瞬变的Ca2+和SR中 Ca2+的含量，尤其是在雌鼠中[38]。这同样表明，冠脉结扎后发生的心律失常中，nNOS通过S-亚硝基化、调节关键钙处理蛋白（例如LTCCα1c、SERCA2和RyR2）的活性，减少Ca2+流入和舒张/收缩时Ca2+的瞬变振幅来保护心脏[31]。此外，nNOS通过加强对外周迷走神经敏感的心率的调节来发挥抗心律失常作用[7]。事实上，对迷走神经的刺激能增加左室nNOS产生NO，并发挥抗心律失常作用[39]。已知在心脏病中，全身的交感神经兴奋性增高，而nNOS通过迷走神经调控心率在减少致命性室性心律失常上有着重要的临床意义[40]。

在患病心脏中的线粒体和肌丝中，nNOS-依赖的传导路径的作用还并不是很清楚。有条件的nNOS过量表达小鼠中，nNOS蛋白表达在线粒体中有所提高，NO对心脏的效果也有所增强。因此，nNOS通过减少线粒体活性氧和黄嘌呤氧化还原酶（XOR）来减少氧化应激。nNOS还通过伴随缺血再灌注过程减轻心肌梗死面积[41]。有趣的是，在类似的小鼠模型有条件的过度表达nNOS中，nNOS作用位置、下游靶蛋白、作用机理这些方面与之存在鲜明的对比。例如，主要位于SR的过表达的nNOS增加了 LTCC的活性和 PLN-SER16，并导致［Ca2+］i的加速衰减。相反，浆膜中过表达的nNOS能增加其与LTCC的结合，降低LTCC活性，减少对PLNSER16的影响，因此减缓了［Ca2+］i的衰减。这些结果进一步印证了nNOS的空间定位和其下游靶蛋白决定心肌疾病类型的重要性。

2 nNOS基因、转录和调节

2.1 nNOS基因、多启动子/转录和nNOS剪接变异体 人类的nNOS（或者叫NOS1）基因位于12号染色体q24.2，这个位点分布在一个240 kb的区段中。负责转录出mRNA那条核苷酸序列由29个外显子编码，并翻译出包含1434个氨基酸、推测质量约为160 kDa的蛋白质[29]。nNOS基因有9种独特的外显子1，在不同组织中的转录起始发生变异，每一个转录均从5′端的一个特别区段表达而来。这使得nNOS的转录/表达调控变得极其复杂。本质上说，nNOS基因多样的结构各异的mRNA由大量的转录单元来转录。产生多样mRNA的机制包括分散启动子、可变剪接、盒式外显子、缺失或插入和可选择性多聚腺苷酸化信号的运用。在神经元和肌肉中，nNOS启动子都被聚集在外显子2基因区段的上游。多种mRNA是由不同酶特异性和结构特点编码nNOS蛋白而成的[42]。位于下游外显子2的启动子的启动，使转录因子得以表达。它们利用多个转录起始部位，并产出截短蛋白（如nNOSβ或nNOSγ）；nNOSβ（而不是 nNOSγ）保留酶的活性，但是缺乏一种主要的PDZ蛋白——蛋白相互作用结构域，而它负责使nNOS作用于浆膜或核膜[43]。不同的转录起始、加工处理、翻译效率和稳定性、定位使得nNOS的转录子容易受到多种因素的影响并产生多种亚型。到目前为止，5种结合的变异体已被发现 （nNOSα、nNOSβ、nNOSγ、nNOSμ 和 nNOS2）。然而对它们在心肌中的特异性、功能相关性和机制方面却知之甚少。现已知，nNOSα和nNOSμ含有PDZ结构域，并与α-syntrophin相连定位于质膜上。nNOSμ相比于nNOSα，插入了34个氨基酸，这使得它与nNOSα在电子传递速率、通过CaM调节电子流速、形成血红素-亚硝基复合体这些方面有所不同[44]。nNOSβ和nNOSγ不含PDZ结构域，并且可能位于细胞质中。

2.2 非心肌组织中nNOS基因的调控 尽管在左室或心房发生各种病理生理损害时，nNOS的mRNA和蛋白的表达有所增加，但是，心脏nNOS的基因调控（转录和翻译机制）却是很少的。理解nNOS的转录调控对于明确剪接变异体在正常心血管生理或疾病时的转录/翻译是很重要的。在神经元、骨骼肌、血管、胃肠道平滑肌，nNOS转录的调控通过转录因子如 CREB、SP/ZNF家族或 NF-kB来实现[29]。在神经细胞中，CREB通过结合Sirt-1染色质来调节sirtuin的转录；继而Sirt-1被招募到DNA并提高CREB-依赖的nNOS的表达[45]。对人类nNOS基因5′端区域序列的分析揭示了AP-2、TEF-1/MCBF、CREB/ATF/cFOS、Ets、NF-1 和 NF-kB-like序列可能的结合位点[29]。所有这些转录因子均存在于心肌细胞，因此这些信息为寻找参与影响心肌细胞nNOS基因调控的机制提供了有价值的线索。

同样，nNOS在非心脏组织中的存在也能增加对nNOS剪接变异体和其在心肌中的功能的了解。例如，众所周知，在动物模型和人类中，骨骼肌运动后nNOSμ均发生上调，nNOSμ的mRNA表达和蛋白质水平同运动后血管再生相关[46]。最近发现nNOSβ作用于高尔基体，并且在维持鼠类骨骼肌和运动后肌肉力量上起着至关重要的作用，对于增加肌肉抗疲劳也同样起着至关重要的作用[47]。这些结果表明，nNOS剪接变异体的功能意义也适用于骨骼肌各种功能的调节。然而，nNOS变异体（nNOSα、nNOSβ和nNOSμ）在心肌细胞中是否存在特有的功能还并不是很清楚。在处于孕晚期大鼠的肾皮质中，nNOSβ蛋白表达有所提升，而nNOSα却有所下降；因此抗氧化能力有所提升，使得肾皮质在氧化应激中得到保护。此外，高盐饮食（0.4%～4.0%）增加nNOSβ在大鼠肾脏内髓集合管的表达远远多于nNOSα[48]。nNOSβ的这种变化同样发生在右肾切除、左肾2/3切除或梗死的模型和肾移植模型中[49]。同样的，在小鼠近端结肠神经元发现弛缓素能增加nNOSβ的表达，但是减少nNOSα在平滑肌细胞的表达，致使肌张力减小，并增加肌肉随意收缩的幅度[50]。这进一步表明了nNOS剪接变异体在应对病理生理刺激时有独特的调节作用。

3 展望未来：nNOS在患病的心脏中可能产生的影响

在正常心脏中，nNOS调节基础心肌收缩和舒张，这对于阻止疾病进展和致命性心脏病的发展来说是一种重要的保护机制。nNOS调控的转录后修饰是新兴的研究方向，并能增加我们对nNOS在心血管疾病中发挥重要作用的理解。在多种生理系统中，nNOS基因调控对于病理生理的刺激、独特的nNOS剪接变异体和各自的区域/结合伴侣这些方面是已知的，但是，在心脏方面认知的提高，还需要有效治疗策略的进一步发展。

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Molecular mechanisms of nNOS in cardiac function and pathophysiology

Neuronal nitric oxide synthase；Nitric oxide；Cardiac function；Signaling pathways

国家自然科学基金（项目编号：81460039）；吉林省科技厅青年科研基金（项目编号：20140520024JH）；吉林省卫生厅青年科研基金（项目编号：2014Q043）

133000 吉林省延边市，延边大学附属医院心内科

金春子，E-mail：15526771826@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.001

R54

A

1672-5301（2016）08-0673-06

2016-01-17）