冠突散囊菌液体发酵工艺的研究

李文娟， 吕嘉枥， 闫亚梅， 王霄鹏

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安　710021)



冠突散囊菌液体发酵工艺的研究

李文娟， 吕嘉枥*， 闫亚梅， 王霄鹏

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安710021)

摘要：以陕西茯砖茶中优势菌群冠突散囊菌为实验菌株，采用液体深层发酵培养，研究了不同培养基成分、不同培养条件对菌丝球生长的影响.实验结果表明优化培养基配方为：土豆20%、蔗糖4%、硝酸铵0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%；最适合菌丝球生长发育的理化因素为：培养温度28 ℃、摇瓶转速为120 r/min、pH5.0、摇瓶装液量25%、发酵时间7 d、种子培养时间为5 d.

关键词：冠突散囊菌； 液体发酵； 菌丝体

0引言

某些丝状真菌在液体摇床培养条件下能自动聚集成球状，所得菌体生长代谢活跃，有利于有效成分的积累.菌丝球的形成受自身条件和外界条件

的影响[1]，菌种的性质和培养条件都会影响菌丝球的大小和致密程度，从而影响发酵生产的效率，实践证明小而致密的菌丝球比表面积大，能充分利用营养且易于过滤.因此，从理论和实践上解决如何形成小而致密的菌丝球，对工业发酵生产有指导意义.

冠突散囊菌[2-5]是茯砖茶中的优势菌群，在茯砖茶“发花”过程中通过控制外界的条件可以促使其生长繁殖，产生金黄色素的闭囊壳，俗称“金花”，边区消费者历来根据“金花”的质量和数量来判断茯砖茶品质，边区有“茶好金花开，花多茶质好”之说.

由于冠突散囊菌的存在，赋予了茯砖茶特有的色、香、味[5,6]，并且具有促消化、降脂减肥、抑制肿瘤细胞和治疗心血管疾病[7-10]等保健功效.冠突散囊菌在固体培养时，呈现大片的金黄色菌落，长势旺盛，但是不适合大规模的生产；利用现代液体发酵技术对冠突散囊菌进行培养，周期短、成本低、产量大，可以实现大规模工业化生产，而且发酵液和菌丝体中含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸[11-13]等人体益生成分，营养价值高，其中多糖时具有营养保健价值的内含成分.

邓放明等[14]利用冠突散囊菌发酵液分离出胞外多糖，选用PPARs、K526、HepG2模型初步研究其降脂和抗肿瘤活性，发现胞外多糖对PPARα、PPARγ、PPARδ3中模型均有活性.吕嘉枥等[15]对冠突散囊菌发酵液进行了研究，证明冠突散囊菌液体发酵液提取液中含有降脂成分洛伐他汀，分别为酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀.

本文以陕西茯砖茶中优势菌群冠突散囊菌为试验菌株，研究不同培养基成分、不同培养条件冠突散囊菌菌丝球形成的影响，为冠突散囊菌菌丝体及其发酵液的进一步开发和利用提供理论参考，同时对其实现工业化生产产生积极的指导作用.

1材料与方法

1.1　菌株和培养基

(1)斜面培养基：CZG(5%NaCl)培养基(蔗糖4 g、NH4NO30.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaCl 5 g、琼脂2 g、水100 mL，121 ℃灭菌20 min).

(2)发酵培养基：PDA培养基(将马铃薯清洗干净、去皮切成小块，称取200 g马铃薯小块加入蒸馏水煮沸20 min，用四层纱布过滤，在滤液中添加40 g葡萄糖，继续加热搅拌均匀，冷却后添加水分到1 000 mL，在121 ℃灭菌20 min).

1.2　试剂和仪器

(1)试剂：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、β-环状糊精、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、酵母浸粉、牛肉膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、 KCl、NaCl、硫酸亚铁，均为分析纯.

(2)仪器：超净工作台(苏净集团安泰公司)；DHP9080电热恒温培养箱(上海佳胜实验设备有限公司)；LS-C50L型立式高压蒸汽灭菌锅(江阴滨江医疗设备厂)；101-1型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；震荡培养箱(哈尔滨市东联电子有限公司).

1.3　发酵及测定流程

采购新鲜马铃薯→马铃薯洗净去皮→称重切块0.5～1.0 cm3→蒸馏水加热煮沸20 min过滤→添加不同的成分→搅拌均匀→分装到规格的锥形瓶→高压灭菌(121 ℃，20 min)→平板接种→摇床发酵培养(28 ℃，120 r/min)→定量滤纸过滤→收集菌丝体→测定干重.

1.4　营养成分对菌丝球形成的影响

1.4.1不同种类碳源对菌丝球干重影响

以PDA为基础培养基，菌丝球干重为指标，分别加入不同种类的碳源(葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、β-环状糊精)取代培养基中的碳源，在28 ℃，120 r/min培养7天.将摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.4.2不同含量的蔗糖对菌丝球干重影响

以PDA为基础培养基,菌丝球干重为指标，分别加入2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖，在28 ℃，120 r/min培养7天.将摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.4.3不同氮源对菌丝球干重影响

以添加4%蔗糖的PDA为基础培养基,菌丝球干重为指标，分别加入1.0%不同氮源(蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏、酵母浸粉)，在28 ℃，120 r/min培养7天.将摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.4.4不同含量的硝酸铵对菌丝球干重影响

以添加4%蔗糖的PDA为基础培养基，菌丝球干重为指标，分别加入0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%硝酸铵，在28 ℃，120 r/min培养7天.将摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.4.5不同种类无机盐对菌丝球干重影响

以添加4%蔗糖、0.3%硝酸铵的PDA为基础培养基，菌丝球干重为指标，分别添加不同种类和含量的无机盐(0.05% MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.05%KCl、0.05%NaCl、0.001%FeSO4)，在28 ℃，120 r/min培养7天.将摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.4.6优化培养基配方的确定

综合上述实验，考虑到原料及成本价格，选择蔗糖为碳源，硝酸铵为氮源，MgSO4·7H2O和KH2PO4为无机盐，以菌丝球干重为指标，进行L9(34)正交试验,如表1所示.根据试验结果确定冠突散囊菌液体发酵培养基的优化配方.

表1　L9(34)试验因素及水平

1.5　培养条件对菌丝球形成的影响

1.5.1pH对菌丝球干重影响

以优化后PDA为基础培养基，用NaOH或HCl调培养基pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在500 mL三角锥形瓶中装液125 mL，在28 ℃，120 r/min条件下恒温震荡培养7天.将三角摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.5.2装液量对菌丝球干重影响

以优化后PDA为基础培养基，在三角锥形瓶中分别加入15%、20%、25%、30%、35%的培养基，接入菌种，在28 ℃，120 r/min培养7天.将三角摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.5.3培养温度对菌丝球干重影响

以优化后PDA为基础培养基，分别在26 ℃，28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，120 r/min恒温震荡培养7天.将三角摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.5.4摇瓶转速对菌丝球干重影响

以优化后PDA为基础培养基，在28 ℃，100 r/min、 110 r/min、120 r/min、130 r/min、140 r/min恒温震荡培养7天.将三角摇瓶培养的发酵液用定量滤纸过滤，用蒸馏水洗涤多次，收集其菌丝球，放置在30 ℃～40 ℃的恒温培养箱中烘干，至恒重后取出，每个因素做三个平行实验.

1.5.5冠突散囊菌液体发酵最佳发酵条件的确定

通过对冠突散囊菌液体发酵培养基成分的优化，可以确定冠突散囊菌最佳液体培养基，即为：土豆20%、蔗糖4%、硝酸铵0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%.为进一步确定摇床最佳培养条件，参照前人研究成果并结合试验结果，设计正交试验，对因素及水平进行选择,如表2所示.

2结果与讨论

2.1　培养基成分菌丝球形成的影响

2.1.1碳源及其含量的确定

碳是真菌最重要的营养元素，它不仅是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，又是重要的能量来源.选择几种常见的原料作为碳源比较，其浓度为4%.

由表2可知，冠突散囊菌对碳源的利用比较广泛，对单糖、双糖、多糖均可利用.其中，蔗糖为最适合的碳源，其次为葡萄糖，麦芽糖、乳糖对菌丝球产量影响相当，β-环状糊精产量最低.所以本试验选择蔗糖做为碳源.

表2　碳源对菌丝产量的影响

以蔗糖为最佳碳源，分别按照2%、4%、6%、8%、10%的量加入培养基，确定较佳蔗糖含量.

由表3可知，蔗糖含量对菌丝球的产量影响不显著，均在0.20%左右，推其原因可能是土豆汁里浸出的淀粉做为部分碳源被冠突散囊菌所利用，因此，选择添加蔗糖含量为4%.

表3　蔗糖含量对菌丝产量的影响

2.1.2氮源及其含量的确定

氮素是真菌合成的蛋白质、核酸的必要原料，对菌丝生物生长发育至关重要.选择几种常见原料作为氮源进行比较，其浓度为1.0%.

由表4可知，不同的氮源对菌丝球产量影响较大，添加硝酸铵和硫酸铵的培养基中菌丝球生长良好，发酵液澄清黄亮，而加入有机氮源菌丝球呈现褐色，发酵液浑浊.说明无机氮源比有机氮源更有利于菌丝球生长，其中加入硫酸铵菌丝球直径大，组织不紧密，因此选择硝酸铵为较佳氮源.

表4　氮源对菌丝产量的影响

以硝酸铵为较佳氮源，分别按照0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的量加入培养基，确定较佳氮源含量.

由表5可知，硝酸铵含量在0.3%～2.0%范围内菌丝球都可以很好地生长，形成的菌丝球大小均一，组织紧密，但是硝酸铵含量超过1.0%时，发酵液散发出刺鼻的气味，浓郁的菌花香被破坏.因此，选择0.3%为硝酸铵的较佳含量.

表5　硝酸铵含量对菌丝产量的影响

2.1.3无机盐的确定

据资料报道，液体培养基中缺乏P、S、K、Mg，菌丝体生长发育不良，菌丝体产量低，选择常用的5种无机盐进行试验，确定较佳的无机盐.

由表6可知，5种无机盐对菌丝体生长作用差异不显著，其中加入KH2PO4和MgSO4·7H2O时菌丝球长势好，发酵液颜色黄亮.因此本试验选取常用的KH2PO4和MgSO4·7H2O作为较佳的无机盐.

表6　不同无机盐对菌丝产量的影响

2.1.4优化培养基配方的确定

综合上述试验结果，又考虑原料来源及成本价格，选用蔗糖为碳源，硝酸铵为氮源，MgSO4·7H2O和KH2PO4作无机盐，进行L9(34)正交试验.

根据表7,采用直观分析法分析正交试验结果，从9组试验菌丝球干重来看，第五组试验的菌丝球产量最高为0.43 g/100 mL，较优组合是A2B2C3D1，而经方差分析计算得到的较优组合是A2B1C3D1.将未做过试验的A2B1C3D1组合和已做过试验的A2B2C3D1组合进行对比试验，3次重复，测定菌丝干重，试验结果表明A2B1C3D1组合的菌丝产量最高，达到0.48 g/100 mL.所以确定了冠突散囊菌液体深层发酵的培养基配方为：土豆20%、蔗糖4%、硝酸铵0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%.

表7　各组分正交试验结果

2.2　发酵条件对菌丝球形成的影响

2.2.1种子培养时间对菌丝干重的影响

用平板对冠突散囊菌进行培养，分别选取经过4、5、6、7、8天培养的菌接种，发酵6天，测定其菌丝干重.

图1　菌种培养时间对菌丝干重的影响

摇瓶发酵培养6天，测定菌丝干重可以看出，平板培养5天的种子最适宜接种.没有成熟的冠突散囊菌孢子数量少且颜色浅，成熟后变为深黄色，接入的孢子数量多，产生的菌丝则多，菌丝球之间竞争生长空间，因而形成小而致密、机械强度高的菌丝球；接入的孢子数量少，菌丝球变大而数量减少，其机械强度也差，说明成熟的孢子更容易形成均一、紧密的菌丝球.

2.2.2培养温度对菌丝干重的影响

温度是影响菌丝生长发育很重要的一个因素，本试验设计5个温度梯度进行发酵培养.

由图2可看出，30 ℃发酵培养菌丝产量最高.在26 ℃以下，菌体生长相对缓慢，28 ℃为最适生长温度，在32 ℃～34 ℃范围也可以生长，周期较28 ℃～30 ℃长，温度过高，容易染菌，因此培养温度不能过高.

图2　菌种培养温度对菌丝干重的影响

2.2.3培养基起始pH值对菌丝产量的影响

液体培养基提供菌丝体正常生长的外部环境，其酸碱度直接影响菌丝体的新陈代谢，研究表明真菌适宜在酸性环境中生长.本试验设计5个pH梯度进行液体培养.

由图3可知，pH在4.5～6.5之间适宜菌丝的生长，而在pH5的环境下菌丝体产量最高.

图3　起始pH对菌丝干重的影响

2.2.4摇瓶装液量对菌丝干重的影响

冠突散囊菌属于好氧型的真菌，摇瓶装样量对氧气的溶解有很大的影响.本试验设计5个梯度进行液体培养.

由图4可知，500 mL三角瓶装液量125～175 mL时，菌丝产量较理想，而装液量175 mL最高.装液量过多影响菌丝体的好氧需求，菌丝的产量减小；装液量过少营养物质供应不足，菌丝球形成慢且菌丝产量低.

图4　摇瓶装液量对菌丝干重的影响

2.2.5摇瓶转速对菌丝干重的影响

摇瓶转速对菌丝球的形成有很重要的作用.本试验设计5个梯度进行液体培养.

由图5可知，在转速为120 r/min时，菌丝产量最高.转速慢，培养基内的溶解氧少，形成的菌丝球大而松散，菌丝球中间的菌丝处于饥饿状态，影响菌丝的生长；转速过快摇瓶内的机械刺激强烈，也影响菌丝的生长，而且转速过高，容易引起培养液的飞溅，弄湿纱布，引起污染.

图5　摇瓶转速对菌丝干重的影响

2.2.6发酵时间对菌丝干重的影响

由表8可以看出，冠突散囊菌液体发酵5 d，菌丝体长势最好，产量最高.在初期生长比较缓慢，随着发酵进程的不断深入，菌丝体生长越来越旺盛，到第5 d菌丝体产量达到最高峰，之后生长趋于稳定.到第7 d菌丝体出现自溶现象，生物量有所下降.

表8　发酵时间对菌丝干重的影响

3结论

液体发酵技术，不仅能在短期内能获得大量的目标产物，而且周期短，不受季节和环境的限制.但是在培养过程中容易发生杂菌污染，灭菌温度、压力、时间不达标均会引起污染，因此培养基在灭菌时一定要彻底，严格掌握灭菌程序，另外要保证实验过程中的无菌操作.

本试验利用液体发酵技术结合正交试验方法筛选出了菌丝球生长发育的液体培养基配方：土豆

20%、蔗糖4%、硝酸铵0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%；最适合菌丝球生长发育的理化因素为：培养温度28 ℃、摇瓶转速为120 r/min、pH5.0、摇瓶装液量25%、发酵时间7 d、种子培养时间为5 d.

本试验为冠突散囊菌工业化生产菌丝球提供了依据，为进一步研究其发酵液的生物活性奠定了基础，同时可以大幅度地降低冠突散囊菌开发的成本.所以采用液体发酵技术生产菌丝球是一种实用的方法，具有广阔的发展前景.

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【责任编辑：陈佳】

Study on liquid fermentation technology ofEurotiumcristatum

LI Wen-juan， LV Jia-li*， YAN Ya-mei, WANG Xiao-peng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Taking Eurotium cristatum,the superiority strains in Fuzhuan brick tea of Shaanxi,as test subjects,using liquid fermentation culture and L9(34) orthogonal test to study the effects on mycelia by various media and conditions.The result showed that the optimal culture medium was:potato 20%，sucrose 4%，ammonium nitrate 0.3%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.03%.The optimal fermented condition was:culture temperature 28 ℃,rotation speed 120 r/min,pH5.0,the amount of liquid 125 mL(500 mL canonicalflask),incubation time for seed liquid 5 days,and fermentation time 7 days.

Key words:Eurotium cristatum; liquid fermentation; mycelium

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2016)01-0128-06

通讯作者:

作者简介:李文娟(1989-)，女，甘肃天水人，在读硕士研究生，研究方向：食品科学吕嘉枥(1964-)，女，陕西三原人，教授，研究方向：应用微生物学，Lujl@sust.edu.cn

基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目(2010JK446)； 咸阳市科技计划项目 (2013K06-09)

收稿日期:*2015-12-11 *2015-11-23