蛋白质指纹图谱技术在诊断白血病四种分型中的应用

黄　华，　陈林兴，　林美册，　黄靖宇

(汕头大学医学院第二附属医院，广东 汕头 515041)

蛋白质指纹图谱技术在诊断白血病四种分型中的应用

黄华，陈林兴，林美册，黄靖宇

(汕头大学医学院第二附属医院，广东 汕头 515041)

摘要：目的对白血病典型的4种分型血清样本进行检测分析，建立白血病分型的蛋白质指纹图谱诊断模型。方法应用蛋白质指纹图谱技术检测16例急性粒细胞白血病M2a、18例慢性粒细胞白血病、14例急性淋巴细胞白血病及16例急性粒细胞白血病M3，采用Biomarker Wizard 及Biomarker Patterns 5.0软件进行标记物的比较判别，建立决策树诊断模型。结果由m/z 3 376、8 055及9 421建立决策树诊断模型，其中16例急性粒细胞白血病M2a检出率为75.0%(12/16)、9例慢性粒细胞白血病检出率为100.0%(18/18)、14例急性淋巴细胞白血病检出率71.4%(10/14)、16例急性粒细胞白血病M3检出率为87.5%(12/14)。结论由3个蛋白标记峰构成的蛋白质指纹图谱诊断模型为白血病4种分型的诊断提供了新的借鉴和参考。

关键词：白血病；分型；蛋白质指纹图谱技术

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0173-04R446.11

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.017

Abstract:ObjectiveTo establish protein fingerprinting model for the diagnosis of leukemia through determining 4 typical types of leukemia. MethodsA total of 16 acute myeloblastic leukemia M2a samples, 18 chronic myelocytic leukemia samples, 14 acute lymphoblastic leukemia samples and 16 acute myeloblastic leukemia M3 samples were determined by protein fingerprinting technology. The comparison of biomarkers was performed by Biomarker Wizard and Biomarker Patterns 5.0 to establish a diagnosis tree model. ResultsThe diagnosis tree model combined with 3 biomarkers ( m/z: 3 376, 8 055 and 9 421) could detect 75% acute myeloblastic leukemia M2a (12/16),100.0% chronic myelocytic leukemia (18/18), 71.4% acute lymphoblastic leukemia (10/14) and 87.5% acute myeloblastic leukemia M3 (12/14). ConclusionsThe protein fingerprinting model established by 3 protein features maybe a novel method for diagnosing 4 types of leukemia.

基金项目：广东省科技计划项目(2010B031600272)

作者简介：黄华，女，1975年生，本科，副主任技师，主要从事骨髓细胞形态学工作。

收稿日期：(2014-08-14)

Application of protein fingerprinting technology in diagnosing 4 types of leukemiaHUANGHua,CHENLinxing,LINMeice,HUANGJingyu.(TheSecondHospitalAffiliatedtoShantouUniversitySchoolofMedicine,GuangdongShantou515041，China)

Key words: Leukemia; Typing; Protein fingerprinting technology

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，具有分化程度的差异性和细胞形态的多形性等特点，其诊断需进行明确分型[1]。国内、外在白血病分型诊断从细胞水平进展到分子水平，但仅靠形态学、免疫组化、遗传学、分子生物学等，并未达到理想的检出率[2-3]。

本研究利用蛋白质指纹图谱技术对白血病典型4种分型血清样本进行检测分析，建立白血病分型的蛋白质指纹图谱诊断模型，为白血病的分型诊断提供帮助。

材料和方法

一、材料

收集白血病4种分型血清样本，其中16例急性粒细胞白血病M2a、18例慢性粒细胞白血病、14例急性淋巴细胞白血病及16例急性粒细胞白血病M3、白血病患者入选标准：样本均来自汕头大学医学院第二附属医院初诊患者，男30例，女34例，年龄4～83岁。所有患者均未接受任何治疗方案，诊断经临床、骨髓形态学、免疫组化染色、流式细胞学、染色体检查，按世界卫生组织(WHO)白血病诊断标准确诊。

蛋白质指纹图谱试剂盒及蛋白指纹图谱仪I型为湖州赛尔迪生物医药科技有限公司产品，All-in-one标准蛋白质芯片为美国Ciphergen公司。

二、方法

1. 样本收集患者外周血采集后立即放入4 ℃冰箱静置1～2 h内，4 ℃离心232×g离心5 min分离血清后，4 ℃离心1 000×g离心5 min，去除所有残留细胞碎片。在冰上将血清转移到新的离心管中，放入-80 ℃冰箱分装保存，限冻融一次[4]。

2. 样本处理(1) 样本蛋白裂解：离心管中依次加入20 μL U9裂解液(9 mol/L Urea，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCl，1% DTT，pH9.0)，和冰浴溶解的10 μL血清样本,混匀，静置30 min；(2) 磁珠活化：WCX纳米磁珠与100 μL 清洗液(50mmol/L NaAC，pH 4.0)反应5 min，重复2次；(3) 磁珠捕获样本目的蛋白：取360 μL清洗液稀释已裂解的血清样本，取100 μL稀释液加至活化后的磁珠，室温反应30 min；(4) 目的蛋白洗脱及上样：取100 μL 清洗液清洗反应后的磁珠5min，重复2次后弃除液体，加入10 μL洗脱液(1%的TFA)混匀， 静置10 min，取4 μL上清液与4 μL能量吸附分子(Sinapinic acid)饱和溶液充分混匀，吸取2 μL混合液点样到钢芯片上，待干后采用蛋白指纹图谱仪Ⅰ型和赛尔迪蛋白芯片软件读取芯片信息。

三、数据采集和标准化处理

采用加有All-in-one标准蛋白质芯片(含有bovine insulin β chain 3 495.9 m/z，human insulin recombinant 5 807.6 m/z，hirudin 7 033.6 m/z 3种蛋白)校正蛋白指纹图谱仪，使相对分子质量的误差范围至0.1%内。蛋白质指纹图谱仪参数设置为激光强度220，检测灵敏度7，优化范围为m/z为2 000 m/z～35 000 m/z，最高50 000。用6 634 m/z对图谱进行相对分子质量校准，激光粒子流强度标准化系数为1。

四、统计学方法

采用Biomarker Wizard 软件及Biomarker Patterns 5.0软件进行标记物的比较判别，建立白血病分型决策树诊断模型。

结果

一、白血病4种分型蛋白质指纹图谱诊断模型的建立

16例急性粒细胞白血病M2a、18例慢性粒细胞白血病、14例急性淋巴细胞白血病及16例急性粒细胞白血病M3，用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns 5.0软件进行标记物的比较判别，建立由m/z为3 376、8 055及9 421的决策树模型(图1)。模型诊断规则为当M 3 376~28 7.319 2且 M 9 421~83≤9.441 81 且M 8 055~09 ≤11.286 4判读为急性粒细胞白血病M2a组；当M3 376~28 > 7.319 2判读为慢性粒细胞白血病组；当M 3 376~28≤7.319 2且M 9 421~83≤9.441 81 且M 8 055~09 > 11.286 4 判读为急性淋巴细胞白血病组，当M 3 376~28≤7.319 2 且M 9 421~83 > 9.441 81判读为急性粒细胞白血病M3组。该模型判读16例急性粒细胞白血病M2a，12例正确，4例错误；18例慢性粒细胞白血病均正确；14例急性淋巴细胞白血病，10例正确，4例错误；16例急性粒细胞白血病M3，14例正确，2例错误(表2)。图2为决策树模型3个差异性峰在白血病4种分型的比较。

图1　决策树诊断模型

分组例数准确率0组(16例)1组(18例)2组(14例)3组(16例)0组1675.000120401组18100.000018002组1471.429201023组1687.50020014

注：0组为急性粒细胞白血病M2a，1组为慢性粒细胞白血病，2组为急性淋巴细胞白血病，3组为急性粒细胞白血病M3。

注：横坐标为蛋白质峰质荷比，纵坐标为蛋白质峰强度

图2m/z为3 376、8 055及9 421蛋白峰表达差异的比较

讨论

目前，国内、外在白血病分型诊断从细胞水平进展到分子水平，但仅依靠形态学、免疫组化、遗传学、分子生物学等，未达到理想检出率。

蛋白质反映了一个细胞真实状态，且差异蛋白质表达更有助于鉴定健康和疾病状态。蛋白组学研究能表现一个既定细胞的所有或特定蛋白质表达特征。分析蛋白质的改变不仅可直接获得功能相关的标志物，且更适于标准化和临床应用[5]。近年，蛋白组学结合质谱技术鉴定肿瘤生物标志物的尝试结果让人们看到了希望，给肿瘤标志物的研究带来新的思维模式。传统的研究方式一次只能分析一个单个的生物标志物，而蛋白组学结合质谱技术可一次获得上百个蛋白质谱峰，通过一定的分析处理，建立决策树诊断模型，使得多个生物标志物联合检测诊断疾病或疾病的分型成为可能[6-7]。

蛋白质指纹图谱技术是继基因芯片技术之后新一代生物芯片技术，已成为当前临床蛋白质组学结合质谱技术研究中较为理想技术平台，其诊断具有快速、早期、简便、准确、灵敏等特点。在国内、外已有利用蛋白质指纹图谱技术诊断胃癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤的报道[8-12]，也取得了重大的突破。ADAM等[13]发现，蛋白质指纹图谱技术不仅能正确区分前列腺癌、前列腺肥大与正常前列腺，而且能从存放5年的前列腺癌患者临床发病前血清中检出与前列腺癌相关的标志物。2013年浙江大学应用蛋白质指纹图谱技术，建立了肺结核症候分型蛋白决策诊断模型。

本研究通过对16例急性粒细胞白血病M2a、18例慢性粒细胞白血病、14例急性淋巴细胞白血病及16例急性粒细胞白血病M3检测分析，用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns 5.0软件进行标记物比较判别，建立由m/z为3 376、8 055、9 421决策树模型，对白血病4种分型的检出率均在70%以上。(4种类型白血病，单从形态上就能区分大多数类型，结合细胞化学、免疫组织化学基本上均能做出正确的鉴别诊断，不知道蛋白质指纹的价值究竟在哪儿？能否对未明确诊断的白血病也进行相关的研究，以发现其价值？)。

随着生活水平的不断提高，人们对身体的健康越来越重视，利用蛋白质谱技术对体验人群进行指纹图谱的分析也成为趋势，本研究也通过健康对照样本和白血病样本进行标记物比较判别，发现白血病样本有22个差异显著的蛋白峰。由于研究样本例数较少，对此模型诊断效能的稳定性有待在今后的研究中进一步扩大样本数对模型进行验证，并从分子生物学水平分析研究模型中标记蛋白的性质，证实这些标记蛋白与白血病的关联性，一旦建立起稳定的诊断模型，依据其标记蛋白表达的高、低，可以在临床发病前预测其是否会发展成为白血病，对可能患病的人群加强监护和预防性治疗，真正发挥SELDI-TOF-MS技术在临床医学中的作用，使白血病的早期发现、早期治疗变为可能。

本研究建立了白血病4种分型的蛋白质指纹图谱诊断模型，具有较高的诊断效能。由于研究样本例数较少，且只针对急性粒细胞白血病M2a、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病M3这4种白血病分型。因此，在今后的研究中还需扩大样本数，进一步完善不同类型白血病之间的鉴别诊断，并从分子生物学水平分离分析研究模型中标记蛋白的性质，证实这些标记蛋白与白血病不同分型的关联性，希望能建立不同临床分型的白血病诊断模式以指导临床诊疗，为白血病的临床诊断研究提供新的思路和方法。

参考文献

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(本文编辑：储怡星)