不同临床分期HIV-1感染者/AIDS患者血样的蛋白印迹试验带型分析

郭　川，　纪琳莹，　吴耀波，　林洁敏，　陈　婉

(汕头市疾病预防控制中心卫生检验科，广东 汕头 515041)

摘要：目的　分析各临床分期的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者血清中病毒蛋白抗体的变化，探讨不同临床分期的HIV-1感染者/AIDS患者蛋白印迹试验(WB)的带型特点。方法　对汕头市2009至2012年确证的部分HIV-1抗体阳性病例进行CD4+T细胞计数，根据计数结果对病例进行分组：原发感染期组(CD4+ ≥500/mm3)；感染中期组(CD4+ ≥ 200 /mm3且<500/mm3)； AIDS期组(CD4+ <200/mm3)；对各组的WB结果进行病毒蛋白(p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160)抗体的阳性率统计以及带型分析。结果　病毒蛋白p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160的抗体阳性率较高(总阳性率分别为98.2%、92.0%、90.8%、89.5%、93.3%、98.7%和97.5%)，且在3个分期组间未见明显变化(P>0.05)；病毒蛋白p17、p39和p55呈现较低的抗体阳性率(总阳性率分别为68.9%、49.1%和42.5%)；蛋白p17的阳性率从原发感染期的91.5%降为感染中期的62.8%(P<0.01)及AIDS期59.3%(P<0.01)；WB结果中的全带型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55的带型是3个疾病分期组患者的常见带型；在3个分期组中，原发感染期中全带型出现率最高(60.8%)，而缺失p17+p39+p55的出现率最低(6.5%)。结论　病毒蛋白p17抗体的阴转可以作为疾病从原发感染期进入感染中期/AIDS期的一个潜在判别指标。

关键词：带型分析；蛋白印迹试验；病毒抗体；阳性率；人类免疫缺陷病毒；临床分期

中图分类号：

不同临床分期HIV-1感染者/AIDS患者血样的蛋白印迹试验带型分析

郭川，纪琳莹，吴耀波，林洁敏，陈婉

(汕头市疾病预防控制中心卫生检验科，广东 汕头 515041)

摘要：目的分析各临床分期的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者血清中病毒蛋白抗体的变化，探讨不同临床分期的HIV-1感染者/AIDS患者蛋白印迹试验(WB)的带型特点。方法对汕头市2009至2012年确证的部分HIV-1抗体阳性病例进行CD4+T细胞计数，根据计数结果对病例进行分组：原发感染期组(CD4+≥500/mm3)；感染中期组(CD4+≥ 200 /mm3且<500/mm3)； AIDS期组(CD4+<200/mm3)；对各组的WB结果进行病毒蛋白(p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160)抗体的阳性率统计以及带型分析。结果病毒蛋白p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160的抗体阳性率较高(总阳性率分别为98.2%、92.0%、90.8%、89.5%、93.3%、98.7%和97.5%)，且在3个分期组间未见明显变化(P>0.05)；病毒蛋白p17、p39和p55呈现较低的抗体阳性率(总阳性率分别为68.9%、49.1%和42.5%)；蛋白p17的阳性率从原发感染期的91.5%降为感染中期的62.8%(P<0.01)及AIDS期59.3%(P<0.01)；WB结果中的全带型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55的带型是3个疾病分期组患者的常见带型；在3个分期组中，原发感染期中全带型出现率最高(60.8%)，而缺失p17+p39+p55的出现率最低(6.5%)。结论病毒蛋白p17抗体的阴转可以作为疾病从原发感染期进入感染中期/AIDS期的一个潜在判别指标。

关键词：带型分析；蛋白印迹试验；病毒抗体；阳性率；人类免疫缺陷病毒；临床分期

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)02-0145-04R446.61

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.010

基金项目：汕头市医疗科技计划项目(汕府科[2013]88号)

作者简介：郭川，男，1981年生，硕士，主管技师，主要从事病原微生物研究。

Abstract:ObjectiveTo analyze the change of anti-virus antibodies in serum of patients with different clinical stages of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) infection/ acquired immune deficiency syndrome (AIDS), and to investigate the band pattern characteristics of Western blotting (WB). MethodsCD4+T cell counting was determined in the part of HIV-1 confirmed cases in Shantou from 2009 to 2012. According to the results, these cases were classified into 3 groups, primary-stage infection group (CD4+≥500 /mm3), middle-stage infection group (CD4+≥ 200/mm3and CD4+<500 /mm3) and AIDS group (CD4+<200 /mm3). The WB results of the 3 groups were analyzed and performed to determine the positive rates of antibodies against viral proteins (p17， p24， p31， p39， gp41， p51, p55， p66， gp120 and gp160) and the band patterns of WB. ResultsThe antibodies against viral protein p24， p31， gp41， p51， p66， gp120 and gp160 showed high total positive rates (98.2%, 92.0%, 90.8%, 89.5%, 93.3%, 98.7% and 97.5%, respectively) , while the positive rates had no obvious difference among the 3 stages (P>0.05). The antibodies against viral proteins p17, p39 and p55 showed low positive rates (68.9%, 49.1% and 42.5%, respectively). The positive rate of protein p17 showed an obvious declining between primary-stage infection groups (91.5%) and middle-stage infection group 62.8% (P<0.01)as well as AIDS group 59.3% (P<0.01). All bands, missing p39+p55 and missing p17+p39+p55 were the common band patterns of WB among the 3 groups. Primary-stage infection group showed the highest appearance rate (60.8%) of all bands but the lowest appearance rate (6.5%) of missing p17+p39+p55. ConclusionsTurning negative of antibody against viral protein p17 could be used as a potential distinguish parameter to forecast the disease progression of HIV-1 from primary-stage infection to middle-stage infection group/AIDS group.

收稿日期：( 2014-03-10)

The band patterns of Western blotting in different clinical stages of HIV-1 infection/AIDS patientsGUOChuan,JILinying,WUYaobo,LINJiemin,CHENWan.(DepartmentofHealthyLaboratory,CenterforDiseaseControlandPreventionofShantou,GuangdongShantou515041,China)

Key words: Band pattern; Western blotting; Viral antibody; Positive rate； Human immunodeficiency virus; Clinical stage

获得性免疫缺陷综合征(acquired Immune deficiency syndrome，AIDS)是人类因为感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤，严重者可导致死亡的综合征。目前，AIDS已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。根据《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》[1]，AIDS感染者随疾病的进程可分为3期，分别是Ⅰ期(原发感染期)、Ⅱ期(感染中期)和Ⅲ期(AIDS期)。有报道称随着AIDS病程的发展，患者蛋白印迹试验(Western blotting，WB)的结果会出现不同带型特征[2]，从体液免疫的角度体现了HIV对机体免疫系统的破坏程度。因此，本研究通过对汕头市HIV/AIDS进行临床分期，分析各期WB结果中条带的变化特征，探讨不同疾病阶段HIV/AIDS体内血清学指标的变化规律。

材料和方法

一、研究对象

选择汕头市2009至2012年经HIV感染确证试验确定为HIV-1抗体阳性的病例；该部分病例须符合以下条件：(1)经WB确证为HIV-1抗体阳性；(2)在确证为HIV-1抗体阳性后，进行了有效的CD4+T淋巴细胞计数试验。

二、方法

1 .WB(HIV抗体确证试验) 2009至2012年间对汕头市自愿咨询和常规监测的疑似病例进行HIV感染确证试验，采用AutoBlot System 20型全自动WB仪(美国MP公司产品)和HIV1+2型抗体检测试剂盒[新加坡MP生物医学有限公司产品，国食药监械(进)字2008第3403441号]进行试验和判别。WB涉及的条带为p17、p24、p31、p39、gp41、p51、p55、p66、gp120和gp160 10个病毒蛋白的相应抗体。若同时出现gp41、gp120和gp160中2种以上条带，或出现gp41、gp120和gp160中任一条带同时出现p24条带，该病例判为HIV感染阳性病例；若10种病毒蛋白的抗体皆为阳性，则为全条带带型；非全条带的带型记录其所缺失的条带。

2 .CD4+T淋巴细胞计数和疾病分期 采用FACSCount型流式细胞仪(BD公司产品)和T淋巴细胞亚群计数试剂盒[BD公司产品，国食药监械(进)字2011第3403681号]对WB确证的部分HIV-1抗体阳性病例进行CD4+T细胞计数，参照文献[1]中的分期方法及原则分为3组：原发感染期组(CD4+≥ 500 /mm3)；感染中期组(CD4+≥200 /mm3且< 500 /mm3)； AIDS期组(CD4+< 200 /mm3)。

3.各组中WB抗体条带的阳性率统计及其带型分析利用WB的结果对确证的HIV-1抗体阳性的部分病例进行病毒蛋白抗体携带情况分析，归类统计各组中WB抗体条带的阳性率；同时对各组中的WB抗体的带型特点作大致分析。

三、统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析各组之间率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、CD4+T淋巴细胞计数

对368例阳性病例进行CD4+T细胞计数，结果见表1。

表1　各组CD4+T淋巴细胞数值

二、抗体总阳性率

研究共涉及2009至2012年确证的HIV-1抗体阳性病例368例，其中WB结果为出现全部特异性条带者152例，占41.2%；所有研究样本中，抗体特异性条带出现的阳性率各有不同，阳性率最高的特异性条带为p24、gp120及gp160，分别达98.2%、98.7%和98.5%；其次是p66、gp41、p31和p51，在90%左右； p17、p39和p55的阳性率较低，分别为68.9%、49.1%和42.5%。见表2。

三、各疾病分期病例HIV抗体特异性条带的阳性率

各组的HIV抗体特异性条带的出现情况见表2。在疾病3个分期组中特异性条带p24、p31、gp41、p51、p66、gp120和gp160皆维持较高的抗体阳性率，且在3个分期组间未见明显变化(P>0.05)，在3个疾病分期中p24、gp120和gp160抗体阳性率最高(接近100.0%)；阳性率变化较大的特异性条带有p17，在原发感染期该蛋白抗体阳性率较高(91.5%)，但在感染中期和AIDS期中的阳性率发生较明显的降低，分别为62.8%(P<0.01)和59.3%(P<0.01)；在3个分期中都呈现较低的病毒蛋白p39和p55抗体阳性率，在原发感染期和另外2个分期p39抗体差异有统计学意义(P<0.01)，而p55则在3个分期组间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2　WB中各个病毒蛋白的抗体阳性率　(%)

注：与感染中期组比较，*P<0.01；与AIDS期组比较，#P<0.01

四、 各疾病分期的WB带型

有3种带型在各个疾病分期中比较常见，其中全带型为主要的优势带型，说明大多数病例未缺失抗体条带。特别是原发感染期全带型的出现频率为60.8%，感染中期和AIDS期各为35.6%和33.1%；原发感染期全带型的出现频率与其它2期相比较，差异有统计学意义(P<0.01)；同时缺失p39和p55的带型也占有较大比重，但缺失的带型在各分期间的比重未见明显差异(P>0.05)；同时缺失p17、p39和p55的带型在感染中期和AIDS期占有较大比重，缺失率分别为24.7%和29.9%，但在原发感染期仅6.5%，差异有统计学意义(P<0.01)。除上述3种带型以外，其它各带型所占的比例较少，只含有少数几个病例。因此，即使有些带型只出现在某个分期，也不能归为该分期的特征带型。见表3。

表3　各分期WB中的缺失带型

注：与感染中期组比较，*P<0.01；与AIDS期比较，#P<0.01

讨论

了解AIDS疾病进程的方法目前除了根据病例的临床表现之外，还有病毒载量测定和CD4+T细胞计数。病毒载量是HIV在机体内复制和增值水平的直接体现，其数值高低反应出病毒在机体内活动的活跃程度；CD4+T淋巴细胞作为HIV的靶细胞，其数量的多少反应出机体免疫系统被病毒破坏的程度。它们是评估机体免疫系统，确定AIDS疾病分期的重要指标[1]，目前的研究中一般将其用于评估抗病毒治疗的效果[3-5]。虽然HIV主要侵袭CD4+T淋巴细胞，但对免疫系统的破坏却是综合性的。因此，对免疫系统破坏性的评估，体液免疫也应该纳入其中。而WB作为血清学检测的手段，其结果不应单单只用于检测是否感染HIV，还应从试验中获取机体内病毒蛋白抗体的存在情况等信息，以用于综合评价机体的免疫状态。

机体感染HIV后，各种病毒蛋白的抗体陆续产生，因此随着疾病的进程，不同疾病阶段各病毒抗体组分在WB中的条带反应强度各不相同。如有报道称新发感染病例的WB条带反应强度均低于长期感染者相应的条带[6]，说明病毒抗体随着病毒的感染增殖和机体免疫系统的反应有一个增长过程。一般来说，gp41、gp120、gp160分布在包膜上的蛋白在HIV感染后最早激发机体产生抗体。因此，gp41和gp160/gp120是HIV感染后的早期带型。而在早期带型出现3个月左右，WB的带型趋于完全，此时很多的病毒蛋白抗体皆出现阳性[7]。本研究观察到全部特异性抗体条带阳性(全带型)的病例占41.2%。这与邓文青等[8]报道的40.61%结果基本一致。但本研究还观察到在原发感染期，全带型出现的频率较高，为60.8%。但在进入感染中期和AIDS期后，全带型的出现频率分别降至35.6%和33.1%。该差异是不同临床分期群体带型差异的一个表现，说明随着病毒的增殖及机体免疫系统的破坏，各种病毒蛋白的抗体条带呈现一定程度的缺失。但因个体体质的差异，缺失的程度不同，不宜作为个体上疾病进展的预判。gag基因编码的p17、p39和p55蛋白抗体总阳性率较低(p55为42.5%、p39为49.1%、p17为68.9%)，与之前报道[8-9]的抗gag蛋白抗体除了p24为99.65%之外其它条带检出率都较低(p55为48.02%、p39为44.77%、p17为77.44%)的结果基本一致。但是也有报道称p24抗体水平随着AIDS疾病进展呈现下降的趋势[7]，而本研究中观察到p24抗体在3个分期中始终保持着高阳性率，原因有待于后续研究阐明。本研究发现p17蛋白虽然抗体总阳性率较低，但在原发感染期及后2个分期中呈现明显的差异。处在原发感染期的大部分病例该蛋白的抗体为阳性(阳性率为91.5%)，而进入感染中期和AIDS期后，p17抗体阳性率明显下降(阳性率分别为62.8%和59.3%)。在带型分析中，全带型、缺失p39+p55和缺失p17+p39+p55这3种带型在3个疾病分期患者中都占有较大比重，但除了全带型之外，原发感染期主要缺失p39+p55，AIDS期主要缺失p17+p39+p55，而感染中期则两者基本占同等比重，从而也可以看出p17的缺失频率在原发感染期到AIDS期的进程中呈现一种递增的关系。因此，该蛋白抗体转阴可以作为疾病从原发感染期进入感染中期或AIDS期的一个潜在判别依据。

其它病毒蛋白中，gp41、gp160和gp120在疾病的3个分期内始终保持着较高的抗体阳性率。在类似的文献报道中，此3种蛋白抗体在阳性病例中皆呈现接近100.0%的阳性率[8-9]。由于抗体水平在3个分期间的变化不显著，对于疾病进程的判定来说参考意义不大。但其抗体水平为何未受机体免疫系统破坏的影响，以致在3个分期中都维持在高水平还有待后续研究阐明。

参考文献

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(本文编辑：姜敏)