胸腺基质淋巴细胞生成素对效应T细胞分化功能的影响

林静，李秀红，梁磊，王毅，陈海潮，杨征，酉鹏华(陕西省人民医院，西安710068)

胸腺基质淋巴细胞生成素对效应T细胞分化功能的影响

林静，李秀红，梁磊，王毅，陈海潮，杨征，酉鹏华
(陕西省人民医院，西安710068)

摘要:目的探讨体外氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)诱导人血管平滑肌细胞产生的胸腺基质淋巴细胞生成素( TSLP)对效应T细胞分化功能的影响。方法分离并培养人血管平滑肌细胞、人树突状细胞( DC)、初始T细胞，随机分为4组，每组设5个样本。对照组、实验组人血管平滑肌细胞分别经PBS、ox-LDL处理后，取其上清液与DC、初始T细胞共培养; TSLP中和抗体组、中和抗体对照组在实验组的基础上分别加入TSLP中和抗体、TSLP非特异性中和抗体与DC、初始T细胞共培养。采用ELISA法检测各组细胞培养上清液中TSLP及Th17细胞因子IL-17、IL-22、TNF-α水平，流式细胞术检测Th17细胞构成比。结果与对照组比较，实验组培养上清液TSLP、IL-17、IL-22、TNF-α水平及Th17细胞构成比升高( P均＜0.01)。与实验组、中和抗体对照组比较，TSLP中和抗体组TSLP、IL-17、IL-22、TNF-α水平及Th17细胞构成比降低( P均＜0.01)。结论Ox-LDL体外诱导人血管平滑肌细胞产生的TSLP可促进T细胞向Th17细胞分化。

关键词:胸腺基质淋巴细胞生产素;树突状细胞; T细胞; Th17细胞;动脉粥样硬化

Influence of thymic stromal lymphopoietin on differentiation of effector T cells

LIN Jing，LI Xiu-hong，LIANG Lei，WANG Yi，CHEN Hai-chao，YANG Zheng，YOU Peng-hua
( Shaanxi Provincial People＇s Hospital，Xi＇an 710068，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of thymic stromal lymphopoietin ( TSLP) produced by oxidized-low density lipoprotein ( ox-LDL) -induced human vascular smooth muscle cells in vitro on differentiation of effector T cells.Methods Human vascular smooth muscle cells，human dendritic cells ( DCs) andT cells were isolated and cultured.Then we divided them into 4 groups，and 5 samples in each group.The control group and the experimental group were separately simulated with PBS and ox-LDL.The supernatant was incubated with DCs andT cells.TSLP neutralizing antibody group and neutralizing antibody control group were added with TSLP neutralizing antibody，TSLP non-specific neutralizing antibody，then were co-cultured with DC andT cells.The levels of TSLP and Th17cytokines including IL-17，IL-22 and TNF-α were detected by ELISA，and the flow cytometry was used to detect the proportion of Th17 cells.Results Compared with the control group，the levels of TSLP，IL-17，IL-22，TNF-α and the proportion of Th17 cells were increased in the experimental group ( all P＜0.01).Compared with the neutralizing antibody control group，the levels of TSLP，IL-17，IL-22，TNF-α and the proportion of Th17 cells were decreased in the TSLP neutralizing antibody group ( all P＜0.01).Conclusion TSLP produced by ox-LDL-induced human vascular smooth muscle cells in vitro could promoteT cells differentiating into Th17 cells.

Key words:thymic stromal lymphopoietin; dendritic cells; T cells; Th17cells; atherosclerosis

TSLP受体结合，在效应性T细胞的分化中起重要作用。但其具体作用机制尚不明确。2013年2月～2014年12月，我们对氧化型低密度脂蛋白( ox-LDL)诱导人血管平滑肌细胞产生的TSLP在效应性T细胞分化中的作用进行了探讨。

1　材料与方法

1.1材料淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子( GM-CSF)、重组人IL-4、重组人TNF-α、人TSLP、IL-17、IL-22及TNF-α ELISA试剂盒购自eBiosience公司。FITC-抗人CD11c抗体、PE-抗人CD4抗体、FITC-抗人IL-17抗体、IgG同型对照抗体、TSLP中和抗体、对照中和抗体、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体购自Santa Cruz。T细胞分选试剂盒购自Miltenyi Biotec公司。

1.2人血管平滑肌细胞的培养将人血管平滑肌细胞株(购自中国医学科学院细胞中心)复苏后，于37℃、饱和空气湿度、5% CO2培养箱中培养;待细胞生长至80%～90%融合时，用0.25%的胰蛋白酶+0.01%EDTA消化传代。以1.0×105/mL接种细胞至直径25 cm2培养瓶中进行后续试验。

1.4实验分组及处理①对照组: PBS与人血管平滑肌细胞共培养24 h，去除细胞，取其上清液与DC共培养24 h，与初始T细胞共培养5 d。②实验组: ox-LDL( 50 μg/mL)与人血管平滑肌细胞共培养24 h，去除细胞，取其上清液与DC共培养24 h。去除上清液，PBS冲洗3次，与初始T细胞共培养5 d。③TSLP中和抗体组: ox-LDL( 50 μg/mL)与人血管平滑肌细胞共培养24 h，去除细胞，取其上清液与DC共培养24 h。去除上清液，PBS冲洗3次，在加入TSLP中和抗体( 1 ng/mL)的培养基中与初始T细胞共培养5 d。④中和抗体对照组: ox-LDL ( 50 μg/mL)与人血管平滑肌细胞共培养24 h，去除细胞，取其上清液与DC共培养24 h。去除上清液，PBS冲洗3次，在加入TSLP非特异性中和抗体的培养基中与初始T细胞共培养5 d。每组设5个样本，5 d后，各组共培养系统中加入抗人CD3抗体( 5 μg/mL)及抗人CD28抗体( 5 μg/mL)孵育24 h。

1.5培养上清液中TSLP、Th17细胞因子( IL-17、IL-22及TNF-α)水平检测采用ELISA法。各组细胞培养结束后，收集培养上清液，按照试剂盒的操作步骤检测培养上清液中TSLP、IL-17、IL-22及TNF-α。实验设双复孔，重复3次。

1.7统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料用珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1四组人平滑肌细胞TSLP水平比较对照组、实验组、TSLP中和抗体组、中和抗体对照组TSLP水平分别为( 1.83±0.25)、( 28.83±6.54)、( 3.87± 1.02)、( 24.55±2.95) pg/mL。与对照组比较，实验组上清液TSLP水平升高( P＜0.01) ;与实验组比较，TSLP中和抗体组TSLP水平降低( P＜0.01) ;与中和抗体对照组比较，TSLP中和抗体组TSLP水平降低( P＜0.01)。

2.2四组培养上清液IL-17、IL-22、TNF-α水平比较见表1。

表1　四组培养上清液IL-17、IL-22、TNF-α水平比较( pg/mL，珔x±s)

2.3四组Th17细胞构成比比较对照组、实验组、TSLP中和抗体组、中和抗体对照组Th17细胞构成比分别为( 0.87±0.22) %、( 9.88±2.16) %、( 3.42 ±1.15) %、( 9.25±1.83) %。与对照组比较，实验组Th17细胞构成比明显升高( P＜0.01) ;与实验组比较，TSLP中和抗体组Th17细胞构成比下降( P＜0.01) ;与中和抗体对照组比较，TSLP中和抗体组Th17细胞构成比明显降低( P＜0.01)。

3　讨论

Th17是近年来发现的T细胞亚群，其分泌的细胞因子主要有IL-17、IL-6、TNF-α及IL-22［4］。研究显示，Th17细胞及相关细胞因子在AS患者斑块局部及循环血中大量表达［5］。AS小鼠伴随着Th17炎症反应的激活，而敲除IL-17基因可明显抑制小鼠AS斑块形成［6，7］。Th17炎症反应对AS发生有促进作用，而并非是AS炎症反应的结果或其“伴随效应”。

研究表明，微生物、Toll样受体( TLR)配体以及某些细胞因子如IL-1β均可通过NF-κB途径诱导上皮细胞、纤维细胞、角质细胞及内皮细胞产生诱导型TSLP［8］。不同细胞类型产生的诱导型TSLP所需的刺激原不同［9］。在人气管上皮细胞，单独的TNF-α 或IL-1β刺激可以诱导细胞产生诱导型TSLP［10］;而在小气道上皮细胞中，只有TNF-α及IL-1β联合才可导致诱导型TSLP的产生［11］。因此，不同细胞类型能否诱导产生诱导型TSLP，由细胞所处局部微环境决定。本研究发现，ox-LDL刺激人平滑肌细胞产生TSLP，表明人血管平滑肌细胞所处的ox-LDL微环境是产生诱导型TSLP的决定性因素。TSLP一直被认为是Th2炎症反应的“总开关”，在特异性皮炎、过敏性哮喘等以Th2炎症反应为主的自身免疫性疾病中起主要作用。然而近期研究表明，TSLP也可诱导向Th17细胞亚群分化。Tanaka等［12］研究发现，单独刺激可诱导DC导致效应性T细胞向T2分化，但是TSLP与TLR配体联合共同刺激诱导DC导致效应性T细胞向Th17分化。本研究发现，ox-LDL诱导产生的诱导型TSLP能够激活DC，导致Th17细胞分化、Th17细胞因子表达增加，其可能机制为ox-LDL可作为配体与TLR结合，与TSLP联合共同刺激促使初始T细胞向Th17分化。

本研究发现，与对照组比较，实验组上清液TSLP水平升高，表明ox-LDL可诱导人平滑肌细胞产生TSLP;抗体中和试验发现，TSLP中和抗体可显著降低培养上清液TSLP、IL-17、IL-22水平及Th17细胞构成比，从而阻止DC诱导的Th17细胞分化，进一步表明TSLP在DC诱导的Th17细胞亚群分化机制中发挥重要作用。

综上所述，ox-LDL诱导人平滑肌细胞产生的TSLP可作用于DC，导致效应性T细胞向Th17分化。结合我们前期研究发现的AS斑块中TSLP表达升高及Th17在AS中的重要作用，认为TSLP在AS中的重要作用之一可能为促使T细胞分化，具体作用及分子机制尚需进一步研究。

参考文献:

［1］Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340( 2) :115-126.

［2］Stemme S，Holm J，Hansson GK.T lymphocytes in human atherosclerotic plaques are memory cells expressing CD45RO and the integrin VLA-1［J］.Arterioscler Thromb，1992，12( 2) : 206-211.

［3］Liu X，Li H，Ren X.Signaling cascades initiated by tslp-mediated signals in different cell types［J］.Cell Immunol，2012，279: 174-179.

［4］Kolls JK，Lindén A.Interleukin-17 family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21( 4) : 467-476.

［5］Liu Z，Lu F，Pan H，et al.Correlation of peripheral th17 cells and th17-associated cytokines to the severity of carotid artery plaque and its clinical implication［J］.Atherosclerosis，2012，221( 1) : 232-241.

［6］Usui F，Kimura H，Ohshiro T，et al.Interleukin-17 deficiency reduced vascular inflammation and development of atherosclerosis in western diet-induced apoe-deficient mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，420( 1) : 72-77.

［7］Gao Q，Jiang Y，Ma T，et al.A critical function of th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice［J］.J Immunol，2010，185( 10) : 5820-5827.

［8］Takai T.Tslp expression: Cellular sources，triggers，and regulatory mechanisms［J］.Allergol Int，2012，61( 1) : 613-617.

［9］Zhao H，Li M，Wang L，et al.Angiotensin ii induces tslp via an at1 receptor/nf-kappab pathway，promoting th17 differentiation ［J］.Cell Physiol Biochem，2012，30( 6) : 1383-1397.

［10］Haro H，Komori H，Okawa A，et al.Sequential dynamics of monocyte chemotactic protein-1 expression in herniated nucleus pulposus resorption［J］.J Orthop Res，1997，15( 5) : 734-741

［11］Kanamaru Y，Sumiyoshi K，Ushio H，et al.Smad3 deficiency in mast cells provides efficient host protection against acute septic peritonitis［J］.J Immunol，2005，174( 7) : 4193-4197.

［12］Tanaka J，Watanabe N，Kido M，et al.Human tslp and tlr3 ligands promote differentiation of th17 cells with a central memory phenotype under th2-polarizing conditions［J］.Clin Exp Allergy，2009，39( 1) : 89-100.

收稿日期:( 2015-06-05)

通信作者简介:梁磊( 1974-)，男，主任医师，博士，主要研究方向为动脉粥样硬化分子生物学机制。E-mail: ll008@163.com

作者简介:第一林静( 1979-)，女，主治医师，博士，主要研究方向为动脉粥样硬化发病机制。E-mail: linjing.123456789@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81400333)。

文章编号:1002-266X( 2015)29-0004-03

文献标志码:A

中图分类号:R311.1+44

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.29.002